Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparer les instruments et les solutions chirurgicaux pour la chirurgie
- Autoclave tous les instruments chirurgicaux en acier inoxydable.
- Préparez de l’éthanol à 70 % en diluant de l’éthanol absolu à 200 degrés avec de l’eau distillée désionisée stérile de qualité moléculaire.
- Fixez l’aiguille 29 G à la seringue Hamilton. Nettoyez l’intérieur de la seringue et de l’aiguille Hamilton en aspirant et en éjectant de l’eau nanopure à plusieurs reprises pendant 1 min. Répétez cette procédure avec de l’éthanol à 70 %.
- Retirez le piston et l’aiguille de la seringue Hamilton. Sécher les pièces à l’air libre dans une hotte à flux laminaire O/N.
- Irradiez l’aiguille et la seringue avec de la lumière ultraviolette pendant 30 minutes avant utilisation.
- Préparez une solution saline en dissolvant le chlorure de sodium (NaCl) dans de l’eau de qualité moléculaire jusqu’à une concentration finale poids/volume de 0,9 %. Stérilisez la solution en la filtrant à travers un filtre à pores de 0,2 μm.
2. Préparer l’amyloïde oligomérique bêta (Aβ1-42)
- Monomériser et remettre en suspension l'Aβ1-42 humain recombinant dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 5 mM exactement comme décrit dans la publication de Fa' et autres.
- Diluer 5 mM Aβ1-42 avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile (1x) à 100 μM la veille de l’intervention.
- Bien mélanger la solution par trituration.
- Incuber la solution Aβ1-42 pendant 12 heures à 4°C.
note: Les solutions de contrôle telles que la dilution du DMSO dans du PBS ou du peptide Aβ1-42 brouillé/inverse doivent être préparées de la même manière que pour l’Aβ1-42.
3. Déterminer les coordonnées d’injection
- Utilisez l’atlas du cerveau de souris adultes pour déterminer les coordonnées exactes antéro-postérieure (AP), médiale-latérale (ML) et dorsale-ventrale (DV) pour la région cérébrale d’intérêt.
note: Pour illustrer la technique, nous avons choisi le gyrus denté de l’hippocampe comme cible avec les coordonnées suivantes de la bregma : AP, -2,00 mm ; ML, ±1,3 mm ; DV, -2,2 mm. Le signe négatif précédant la valeur AP indique qu’il s’agit de 2,00 mm en arrière de la bregma. Le signe ± précédant la valeur ML indique les directions gauche et droite à partir du centre. Enfin, le signe négatif précédant la DV indique qu’elle se déplace ventralement à partir de la surface du cerveau.
4. Configuration du cadre stéréotaxique
- Portez un masque chirurgical, une blouse de laboratoire propre et des gants chirurgicaux stériles.
- Essuyez l’instrument stéréotaxique et l’adaptateur de souris avec de l’éthanol à 70 %.
- Posez un champ chirurgical stérile sur le comptoir.
- Placez l’instrument stéréotaxique avec un adaptateur de souris sur le champ chirurgical stérile.
- Essuyez le coussin chauffant de la souris avec de l’éthanol à 70 %. Placez le coussin chauffant sur le lit à cadre stéréotaxique. Utilisez du ruban d’étiquetage de laboratoire à usage général pour coller le coussin chauffant sur le lit de l’adaptateur de souris.
- Fixez le coussin chauffant à la pompe de recirculation d'eau chaude selon les instructions du fabricant.
- Allumez la pompe de recirculation d’eau chaude, réglez la température à 37 °C et attendez qu’elle atteigne cette température.
- Fixez la seringue Hamilton de 50 μl avec une aiguille de 29 G sur le cadre stéréotaxique en la vissant sur l'arbre d'injection vertical motorisé selon les instructions du fabricant.
- Allumez le stérilisateur à billes et attendez qu'il atteigne la température prédéfinie par le fabricant.
note: Ceci est utilisé pour stériliser les instruments en acier inoxydable entre les animaux. Il faut aux instruments 20 secondes de contact avec les billes pour la stérilisation.
- Allumez la plaque chauffante, réglez-la à 42 °C et placez une cage vide et propre sur le dessus.
- Pendant que la seringue Hamilton est fixée sur le cadre stéréotaxique, utilisez l’injecteur stéréotaxique motorisé pour aspirer la solution Aβ1-42.
note: Prélevez plus de 4 μl de la solution dans la seringue, puis utilisez l’injecteur stéréotaxique pour régler le volume d’injection. Faites fonctionner l'injecteur conformément aux instructions du fabricant.
5. Préparation des animaux
- Déterminez le poids de la souris à l’aide de la balance.
- Anesthésier la souris avec un cocktail kétamine/xylazine à 100 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine par injection intrapéritonéale (IP). Surveiller la profondeur de l’anesthésie par la perte du réflexe de pincement de l’orteil.
- Une fois que la souris est sous sédation, prenez la tondeuse à cheveux et rasez-lui la tête pour exposer la peau du crâne.
- Placez la souris sur le coussin chauffant au-dessus du lit stéréotaxique.
- Utilisez la spatule pour ouvrir la bouche et placez les incisives à l’intérieur du protège-dents. Fixez l’embout nasal sur le visage de la souris. Serrez-le doucement et pas trop serré.
- Positionnez les barres transversales bilatérales de l’oreille dans le méat auditif pour sécuriser la tête. Déplacez chaque barre transversale jusqu’à ce qu’elle touche le crâne, puis tournez la vis pour la verrouiller.
- Pour vous assurer que la tête est bien fixée, utilisez votre index pour appuyer doucement sur la tête. Si la tête est correctement fixée, elle ne cédera pas et ne bougera pas lorsqu’elle sera pressée.
- Appliquez une goutte de crème pour les yeux ou un collyre sur les yeux pour les garder humides. Assurez-vous que les yeux sont humides tout au long de l’intervention chirurgicale.
- Pour désinfecter le site chirurgical, utilisez des cotons-tiges stériles pour appliquer une solution de bétadine sur la peau du crâne, suivie d’éthanol à 70 %. Effectuez le nettoyage alterné à la bétadine et à l’éthanol à 70 % 2 fois de plus.
6. Chirurgie et perfusion
- Utilisez un scalpel pour faire une incision de 2 à 3 mm dans la ligne médiane du cuir chevelu, puis utilisez des ciseaux fins droits pour étendre la ligne d’incision à 1,0-1,5 cm pour exposer la suture sagittale, le bregma et le lambda du crâne, points de repère sur lesquels les coordonnées stéréotaxiques sont basées. Utilisez des micro-pinces pour garder la peau écartée.
note: Les positions bregma et lambda sont expliquées dans l’atlas du cerveau de souris « Le cerveau de la souris en coordonnées stéréotaxiques ».
- Prenez un coton-tige, trempez-le dans une solution saline stérile et utilisez-le pour nettoyer le crâne. Ensuite, utilisez un coton-tige propre et sec pour sécher le crâne.
- À l’aide d’un stylo stérile à pointe fine, marquez un point sur le bregma. À l’aide du micromanipulateur stéréotaxique, positionnez la seringue Hamilton de manière à ce que la pointe de l’aiguille touche à peine le point sur le bregma.
- Enregistrez les coordonnées DV.
- Pour vérifier si l’axe AP du crâne est de niveau, déplacez la seringue Hamilton vers l’arrière de manière à ce que la pointe de l’aiguille touche le point lambda.
- Enregistrez la position DV. Assurez-vous que les coordonnées DV pour bregma et lambda sont comprises entre 0,5 mm.
note: L’objectif est de minimiser la différence de VQ entre bregma et lambda.
- Utilisez le micromanipulateur pour ramener l’extrémité de l’aiguille de la seringue Hamilton sur le point de bregma.
- Enregistrez la position AP de départ.
- Calculez la position finale du PA en soustrayant 2,00 mm de la coordonnée du PA de départ.
- Utilisez le micromanipulateur pour repositionner l’aiguille de la seringue Hamilton à la coordonnée AP finale.
- Enregistrez les coordonnées ML actuelles.
- Calculez les coordonnées ML finales gauche et droite en ajoutant ou en soustrayant 1,3 mm à la coordonnée ML de départ.
- Utilisez le micromanipulateur pour déplacer l’aiguille de la seringue Hamilton vers la coordonnée ML finale.
- Touchez la pointe de l’aiguille à la surface du crâne sur les deux coordonnées ML finales et enregistrez les coordonnées DV et assurez-vous que les valeurs sont comprises entre 0,5 mm.
REMARQUE : L’objectif est de minimiser la différence DV entre les deux coordonnées ML finales.
- À une coordonnée finale, tirez l’aiguille de 0,5 à 1 cm au-dessus du crâne. Prenez un stylo stérile à pointe fine pour marquer un point à la surface du crâne. Répétez cette étape pour le côté controlatéral du crâne.
- Balancez la seringue Hamilton pour l’écarter.
- Fixez la tête de perçage de 0,8 mm à la perceuse. Prenez la perceuse à deux mains, placez les coudes sur la surface de la table pour plus de stabilité et positionnez la tête de perceuse légèrement au-dessus du point sharpie sur la coordonnée ML gauche ou droite. Activez la perceuse, abaissez la pointe de la perceuse sur la surface du crâne pour introduire un trou dans le crâne. Répétez cette étape pour le côté controlatéral.
note: Des saignements peuvent survenir à partir des trous nouvellement introduits. S’il y a des saignements, utilisez un coton-tige propre et sec pour tamponner le sang.
- Remettez la seringue Hamilton en position sur l’un des trous ML nouvellement introduits. Abaissez l’aiguille de Hamilton juste après le crâne. À ce stade, veillez à ne pas percer le cerveau. Pour vous assurer que l'aiguille a passé le crâne, prenez votre index et poussez doucement l'aiguille contre le crâne pour vous assurer que l'aiguille ne sort pas du trou.
- Enregistrez les coordonnées DV de départ.
- Calculez la coordonnée DV finale en soustrayant 2,2 mm de la coordonnée DV de départ.
- Abaissez l’aiguille jusqu’à la coordonnée DV finale.
- Activez la pompe d’injection stéréotaxique pour pomper 4 μl d’Aβ1-42 dans le gyrus denté à un débit de 0,5 μl/min.
- Lorsque la perfusion est terminée, laissez l’aiguille en place pendant 1 minute supplémentaire pour minimiser le reflux de la solution hors du site d’injection.
- Déplacez l’aiguille de l’autre côté du cerveau et répétez les étapes 6.13 à 6.18.
7. Retrait des animaux et soins postopératoires
- Dévissez les barres d’oreille et le protège-visage/nez. Retirez la souris de l’appareil.
- Utilisez une pince à motif standard d’étudiant pour fermer le cuir chevelu, puis scellez la plaie avec une suture.
