Étude de l’accumulation d’alpha-synucléine dans les neurones dopaminergiques embryonnaires primaires de souris

Résumé

Source : Er, S. et al., Étude de l’accumulation de α-synucléine induite par des fibrilles préformées dans les neurones dopaminergiques du mésencéphale embryonnaire primaire de souris.J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo démontre le processus de quantification de l’accumulation d’alpha-synucléine dans les neurones dopaminergiques embryonnaires de souris prétraités avec des fibrilles préformées d’alpha-synucléine. Il décrit les étapes de fixation, de coloration et de quantification des neurones dopaminergiques contenant des agrégats d’alpha-synucléine à l’aide de l’immunofluorescence.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation

1. Préparez un milieu neuronal dopaminergique (DPM) avec 0,46 % de D-glucose, 1 % de L-glutamine, 1 % de N2, 0,2 % de primocine, complété par DMEM/F12. Filtrez le DPM après avoir mélangé les ingrédients. Stocker les DPM à 4 °C et ne réchauffer chaque aliquote qu’une seule fois.
   note: Le DPM ne doit pas contenir de facteur neurotrophique dérivé de la glie (GDNF), car il réduira l’accumulation de α-synucléine dans les neurones dopaminergiques.
2. Préparez des pipettes en verre siliconé qui sont extrêmement hydrophobes, minimisant ainsi l’attachement à la surface et la perte de cellules lors de la manipulation initiale des neurones embryonnaires.
   1. Ajouter 10 ml de liquide de siliconation à 1 L d’eau distillée et mélanger en agitant dans un récipient de 2 L. Laissez les pipettes en verre immergées dans la solution de silicium pendant 15 min.
   2. Rincez les pipettes 3 à 5 fois à l’eau distillée. Faites sécher les pipettes pendant la nuit à température ambiante (RT) ou pendant 1 à 2 h dans un espace stérile chauffé à 100-120 °C pour accélérer le séchage.
   3. Stérilisez les pipettes par autoclave standard dans un sac d’autoclave scellé.
3. Préparez des plaques à 96 puits enrobées de poly-L-ornithine (PO) avec des fonds transparents en ajoutant 60 μL de solution PO dans les puits centraux de la plaque à 96 puits à utiliser pour l’ensemencement des neurones, en laissant au moins une rangée/colonne de puits sur les bords de la plaque pour éviter les effets de bord. Conservez la plaque revêtue toute la nuit à 4 °C ou 4 h à RT.
4. Avant de plaquer les cellules, aspirez complètement l’OP et lavez-les trois fois avec 100 μL de 1x tampon phosphate salin (PBS). Aspirez 1x PBS des puits et laissez le couvercle de la plaque ouvert pour un séchage complet.
   note: Il est possible de collecter les bons de commande utilisés et de les filtrer pour les réutiliser. Cette opération peut être répétée deux fois pour la même solution de bon de commande.
5. Ajouter 50 μL de DPM dans les puits préalablement enduits. Aspirez le DPM des puits avec une pointe en plastique de 100 μL et grattez simultanément le fond du puits avec des mouvements circulaires pour enlever le revêtement sur le périmètre de chaque puits. Un îlot recouvert de PO restera au milieu du puits.
6. Sous un capot laminaire, ajoutez 10 μL de DPM au milieu de chaque îlot enduit pour créer des micro-îlots.
   note: Une plaque avec des micro-îlots recouverts de DPM peut être maintenue sous le capot à flux laminaire pendant 1 à 2 h pendant l’isolement des cellules.

2. Isolement du plancher médio-séphale ventral à partir d’embryons de souris E13.5

REMARQUE : Reportez-vous à la Figure 1 pour les étapes de dissection du plancher du mésencéphale.

1. Avant la dissection, remplissez une boîte de Pétri de 10 cm avec le tampon de Dulbecco et conservez-la sur de la glace.
2. Euthanasier une souris femelle enceinte E13.5 selon les directives de l'établissement. Placez la souris à plat sur le dos et vaporisez la partie antérieure du corps avec de l’éthanol à 70 %. Soulevez la peau au-dessus de l’utérus avec des pinces et faites une incision avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer l’utérus.
3. Retirez délicatement l’utérus et placez-le dans la boîte de Pétri préalablement préparée sur de la glace.
4. À l’aide de ciseaux chirurgicaux sous le capuchon laminaire de la RT, retirez soigneusement les embryons de l’utérus. Retirez tous les résidus placentaires des embryons à l'aide d'une pince et placez-les dans une nouvelle boîte de Pétri de 10 cm remplie de tampon de Dulbecco.
5. À l’aide d’une pince à dissection ou d’aiguilles, coupez l’arrière-train de la tête aux endroits marqués de flèches noires sur la figure 1A. Retirez le morceau coupé du reste de l’embryon (figure 1B).
6. Placez l’arrière de la pièce coupée vers l’observateur (Figure 1C) et ouvrez-le doucement de la caudale au crânien (Figure 1D). À partir de 0,5 mm sous l’ouverture crânienne, coupez une région de^{2 mm 2} à 3 mm², illustrée à la figure 1E.
7. Prélever le plancher médio-sencéphale ventral (voir la figure 1F) dans un tube de microcentrifugation vide de 1,5 ml. Gardez le tube de microcentrifugation sur de la glace jusqu’à ce que tous les étages du mésencéphale y soient collectés.
   note: Alternativement, les planchers du mésencéphale peuvent être prélevés à l’aide d’une micropipette de 1 mL après dissection de tous les cerveaux embryonnaires.

3. Etablissement de cultures embryonnaires primaires du mésencéphale à partir d’embryons de souris E13.5 au format de plaque à 96 puits

1. Après le prélèvement des planchers du mésencéphale de tous les embryons dans le même tube de 1,5 ml, retirez le tampon de Dulbecco résiduel et lavez les morceaux de tissu trois fois avec 500 μL de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) sans Ca²⁺, sans Mg²⁺.
2. Retirer le HBSS et ajouter 500 μL de trypsine à 0,5 % dans le tube. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
3. Pendant l’incubation, réchauffer 1,5 mL de sérum fœtal bovin (FBS) à 37 °C, ajouter 30 μL de DNase I au FBS et mélanger. Polissez également au feu la pointe d’une pipette en verre siliconé. Assurez-vous que le trou n’a pas d’arêtes vives et qu’il est à peu près de la même taille qu’une pointe de micropipette de 1 ml.
   REMARQUE : Comme alternative, une pointe de micropipette à faible adhérence de 1 ml peut être utilisée pour la trituration. Cependant, les pipettes en verre siliconé semblent donner les meilleurs résultats.
4. Dès la fin de l’incubation à l’étape 3.2, ajoutez 500 μL du mélange FBS/DNase au tissu partiellement digéré. Utilisez la pipette en verre pour triturer le tissu dans le mélange FBS/trypsine. Triturez jusqu’à ce que les tissus se dissocient en minuscules particules à peine visibles. Évitez les bulles lors de la trituration.
5. Laissez les particules restantes précipiter au fond du tube de microcentrifugation par gravité. Sans pipeter le précipité par le bas, recueillir le surnageant dans un tube conique vide en polypropylène de 15 ml.
6. Diluer la FBS/DNase I de l’étape 3.3 (98:2) avec 1 000 μL de HBSS pour obtenir la FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Mélanger par pipetage de haut en bas. Ajoutez 1 000 μL du nouveau mélange aux particules restantes dans le tube de la microcentrifugation. Triturez à nouveau et répétez l’étape 3.5.
7. Répétez l’étape précédente une fois de plus pour utiliser tous les FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. Une fois que tout le surnageant est recueilli à l’intérieur du tube de 15 mL (à partir des étapes 3.5, 3.7 et 3.8), utilisez une centrifugeuse de table pour faire tourner le surnageant (~3 mL) à 100 x g, pendant 5 min. Retirez le surnageant sans toucher les cellules granulées au fond.
9. Lavez la pastille de cellule en ajoutant 2 mL de DPM dans le tube et faites-la tourner à 100 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et répétez le lavage 2 fois pour minimiser les débris dans les cellules granulées.
   REMARQUE : Utilisez toujours du DPM frais et réchauffé pour les neurones en culture. Pour les étapes de lavage, le DPM n’a pas besoin d’être frais mais doit être préchauffé à 37 °C.
10. Diluez les cellules avec du DPM frais et chaud et transférez-les dans un tube de microcentrifugation. La quantité de DPM pour la dilution dépend du nombre d’embryons utilisés pour la dissection tissulaire. Par exemple, utilisez 150 μL de DPM pour diluer les cellules obtenues à partir de dix embryons.
11. Transférez 10 μL de cellules dans DPM dans un tube de microcentrifugation. Mélangez-les avec 10 μL de colorant bleu Trypan 0,4 %. Comptez les cellules vivantes (c’est-à-dire bleu de trypan négatif) à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
    REMARQUE : Utilisez 30 000 cellules pour le placage par puits pour obtenir ~1 000 neurones dopaminergiques par puits. Si la densité cellulaire est supérieure à ~30 000 cellules par 6 μL, diluez davantage les cellules avec DPM avant le placage afin que le volume d’ensemencement ne soit pas inférieur à 6 μL.
12. Sans toucher le fond des puits, retirez les DPM des micro-îlots créés à l’étape 1.6.
13. Afin d’obtenir une densité cellulaire reproductible au niveau de chaque puits, mélangez les cellules par pipetage doux avant de les plaquer dans le puits. À l’aide d’une micropipette de 1 à 10 μL, ajoutez 6 μL de cellules au milieu du puits à l’emplacement de chaque ancien micro-îlot.
14. Remplissez les puits vides sur les bords de la plaque avec 150 μL d’eau ou 1x PBS pour minimiser l’évaporation des puits contenant des cultures neuronales. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 1 h.
15. Après 1 h, retirez la plaque de l’incubateur, ajoutez 100 μL de DPM dans chaque puits avec des cellules et remettez-la dans l’incubateur.
16. Deux jours après le placage (jour in vitro 2, ou DIV2), prélever 25 μL et ajouter 75 μL de DPM frais pour porter le volume final du média à 150 μL et éviter autant que possible l’évaporation.
17. Remplacez la moitié du milieu par du DPM frais (c.-à-d. retirer 75 μL et ajouter 75 μL de DPM frais) à DIV5. N’effectuez aucune modification de support après DIV5.

4. Induction des agrégats de α-synucléine dans les neurones dopaminergiques embryonnaires primaires par ensemencement avec des fibrilles préformées

Suite à tout travail avec des fibrilles préformées à la α-synucléine (PFF), nettoyez le capot laminaire ou tout équipement qui aurait pu entrer en contact avec les PFF avec du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 1 %, puis avec de l’éthanol à 70 %.

1. Avant l’expérience, diluer les PFF avec 1x PBS jusqu’à une concentration finale de 100 μg/mL. Sonicer les PFF dilués dans des tubes de microcentrifugation à l’aide d’un sonicateur à bain à haute puissance avec refroidissement par bain d’eau à 4 °C pendant 10 cycles, 30 s ON/30 s OFF.
   note: Il est essentiel que les fibrilles soient correctement soniquées pour générer des fragments de ~50 nm de long. La taille des PFF soniqués peut être mesurée directement à partir d’images au microscope électronique à transmission de PFF colorés. La sonication peut être réalisée comme décrit ci-dessus dans un sonicateur à bain haute puissance. Alternativement, un sonicateur de pointe peut être utilisé. Les PFF soniqués peuvent être stockés à -80 °C dans de petites aliquotes pour éviter plusieurs cycles de congélation/décongélation.
2. Sur le DIV8, ajouter 3,75 μL de 100 μg/mL de PFF par puits aux 150 μL de milieu dans le puits jusqu’à une concentration finale de 2,5 μg/mL. Utilisez la même quantité de 1x PBS pour le groupe témoin.
3. Préparez 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans 1x PBS et stockez les aliquotes à -20 °C. Pour ce faire, suivez les étapes ci-dessous.
   REMARQUE : Le PFA est toxique ; porter un masque et des gants pendant la préparation, travailler toujours sous une cagoule laminaire et éliminer tous les déchets solides et liquides de PFA selon les directives de l'établissement.
   1. Chaud 500 mL de 1x PBS dans un récipient de 1 L. Mettez un agitateur dans le récipient et placez le récipient sur un agitateur magnétique avec une fonction de chauffage. Ajustez la température entre 40 et 60 °C pour éviter l’ébullition tout en gardant la solution chaude.
   2. Mesurez 20 g de poudre PFA sous le capot dans un récipient doseur en plastique jetable. Ajoutez délicatement la poudre de PFA dans le récipient rempli de 1x PBS. Commencez à remuer la solution.
   3. Ajouter 200 μL d’hydroxyde de sodium 5 M dans la solution et continuer à remuer pendant ~15 min jusqu’à ce que le PFA se dissolve complètement.
   4. Une fois que la solution semble homogène, ajoutez 168 μL de chlorure d’hydrogène 5 M pour équilibrer le pH à ~7. Vérifiez le pH à l’aide de bandelettes indicatrices de pH jetables de couleur.
   5. Retirez le récipient de l’appareil de chauffage et laissez-le refroidir à RT. Filtrez la solution et les aliquotes pour les stocker à -20 °C. Décongelez les aliquotes à RT avant de les utiliser et ne les recongelez pas après.
4. Sur DIV15, retirez tous les fluides des puits par pipetage. Ajouter 50 μL de PFA à 4 % dans chaque puits pour fixer les cellules et incuber pendant 20 min à RT. Après l’incubation, retirez le PFA des puits et ajoutez 100 μL de 1x PBS dans chaque puits pour laver les cellules. Retirez 1x PBS et lavez-en 2x plus.
5. Laissez 100 μL de 1x PBS dans chaque puits pour éviter le dessèchement. Conserver la plaque à 4 °C jusqu’à ce qu’une immunochimie soit effectuée.

5. Coloration immunofluorescente et imagerie automatisée des neurones dopaminergiques embryonnaires primaires dans des plaques à 96 puits

1. Retirer 1x PBS et perméabiliser les cellules en ajoutant 100 μL de Triton X-100 à 0,2 % dans du PBS (PBST) par puits et en incubant à RT pendant 15 min.
2. Retirez le PBST et ajoutez 50 μL de sérum de cheval normal (NHS) à 5 % par puits dans le PBST. Pour bloquer l’activité de l’antigène non spécifique, incuber à RT pendant 1 h.
3. Diluer les anticorps primaires contre la tyrosine hydroxylase (TH) et la pS129-αsyn (1:2 000) dans 5 % de NHS dans PBST. Ajouter 50 μL d’anticorps dilués dans chaque puits et incuber toute la nuit à 4 °C.
4. Retirez les anticorps et ajoutez 100 μL de 1x PBS dans chaque puits pour laver les cellules. Retirez 1x PBS et répétez le lavage 2x.
5. Pour éviter le blanchiment des molécules fluorescentes, commencez à travailler dans des conditions de lumière minimales. Diluer les anticorps secondaires marqués par fluorescence (1:400) dans le PBST. Ajouter 50 μL d’anticorps dilués dans chaque puits et incuber à RT pendant 1 h.
6. Retirez la solution d’anticorps et ajoutez 100 μL de 1x PBS dans chaque puits pour laver les cellules. Retirez 1x PBS et répétez le lavage 2x.
7. Retirer 1x PBS, ajouter 50 μL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) de 200 ng/mL par puits pour colorer les noyaux des cellules cultivées, et incuber à RT pendant 10 min.
8. Laver les cellules 3x avec 100 μL de 1x PBS pendant 5 min chacune. Conservez 100 μL de 1x PBS dans chaque puits après le dernier lavage. Couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium et rangez-la à 4 °C jusqu’à l’imagerie.
9. Imagez les neurones dopaminergiques embryonnaires primaires dans une plaque de 96 puits avec un scanner de plaque à haut contenu (voir la table des matériaux) équipé d’un objectif 10x.
10. Ajustez les paramètres en fonction des spécifications de la plaque à 96 puits, telles que le type de plaque, le fabricant, la taille, la distance entre les puits, ainsi que le type et la quantité de fluide.
11. Sélectionnez la zone d’imagerie du puits pour couvrir toutes les cellules d’un microîlot. Choisissez bien un exemple pour ajuster l’autofocus. Basez l’accent initial sur DAPI.
12. Calibrez le temps d’acquisition de chaque canal fluorescent en fonction de l’intensité de la coloration dans les puits de contrôle. Ajustez les paramètres de sorte que dans les puits de contrôle traités par PFF, on puisse clairement distinguer les cellules dopaminergiques hébergeant des agrégats pS129-αsyn dans le soma cellulaire, ce qui permet une quantification sans ambiguïté des cellules pS129-αsyn positives et pS129-αsyn négatives.
    note: Les puits qui ne contiennent pas de PFF ne doivent pas présenter de coloration pour pS129-αsyn ; par conséquent, ces puits peuvent être utilisés comme contrôle négatif pour ajuster l’intensité de pS129-αsyn.
13. Imagez tous les puits sélectionnés avec un objectif 10x simultanément pour tous les canaux avec coloration par immunofluorescence avec exactement les mêmes paramètres.
14. Facultativement, marquer les inclusions de α-synucléine dans un sous-ensemble des puits avec des anticorps spécifiques de la α-synucléine filamenteuse pour confirmer que les changements dans le nombre d’inclusions positives à pS129-αsyn reflètent la réduction de l’accumulation de protéines plutôt que l’inhibition de la phosphorylation ou de la déphosphorylation de pS129-αsyn.
15. Répétez l’étape 5.3, en remplaçant l’anticorps pS129-αsyn par un anticorps à filament de α-synucléine (1:2 000). Imagez la α-synucléine agrégée colorée comme à l’étape 5.13.

Résultats

Figure 1 : Dissection du plancher du mésencéphale à partir d’un embryon de souris E13.5. (A) Les emplacements de coupe à l’arrière de la tête sont marqués de flèches noires et de lignes pointillées blanches. (B) Le morceau a été retiré du reste de l’embryon. La pièce retirée est encerclée. (C) La pièce a été tournée à 90° pour faire face à l’a...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,4 % Trypan Bleu colorant	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	15250061
Tube en polypropylène CELLSTAR de 15 ml	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne	188261
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	10236276001
5 M HCl	n/a	n/a	Cuisine multimédia, Institut de biotechnologie, Université d’Helsinki
5 M NaOH	n/a	n/a	Cuisine multimédia, Institut de biotechnologie, Université d’Helsinki
ViewPlate à 96 puits (noir)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, États-Unis	6005182
Éthanol à 99,5 % (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlande	n/a
Fluide de siliconation AquaSil	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	Réf. TS-42799
Tube de microcentrifugation autoclavé de 1,5 ml	n/a	n/a	Cuisine multimédia, Institut de biotechnologie, Université d’Helsinki
Dispositif de sonication Bioruptor	Diagenode, Liège, Belgique	B01020001
Solution saline équilibrée de Hank’s (HBSS) sans Ca2+, Mg2+	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	Référence 14175-053
Progiciels CellProfiler et CellAnalyst	n/a	n/a	Logiciel open source gratuit
Centrifugeuse 5702	Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne	5702000019
Incubateur à CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	n/a
Chambre de comptage	BioRad Inc., Hercules, Californie, États-Unis	1450015
Microscope ultra haute résolution DeltaVision avec table à air et armoire	GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, États-Unis	29254706
Désoxyribonucléase-I (Dnase I)	Roche, Bâle, Suisse	22098700
D-glucose	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	Référence G8769
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	21331–020
anti-souris âne AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	Réf. A21202
âne anti-lapin AlexaFluor 647	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	N° A31573
âne anti-mouton AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	A11015
Le tampon de Dulbecco	n/a	n/a	Cuisine multimédia, Institut de biotechnologie, Université d’Helsinki
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	10500056
Fisherbrand Barre d’agitation en PTFE simple et économique	fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	11507582
Système d’imagerie automatisé ImageXpress Nano	Molecular Devices, San José, Californie, États-Unis	n/a
L-glutamine	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	25030–032
souris monoclonale anti-tyrosine hydroxylase	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Allemand	MAB318
Supplément N2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	17502–048
Sérum de cheval normal	Vector Laboratories Inc., Burlingame, Californie, États-Unis	S-2000
paraformaldéhyde (PFA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	158127
poudre de paraformaldéhyde, 95 %	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	158127
pH-Fix, bandes indicatrices de couleur fixe	Macherey-Nagel, Düren, Allemagne	Référence 92110
Tampon salin phospohate (PBS)	n/a	n/a	Cuisine multimédia, Institut de biotechnologie, Université d’Helsinki
poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	Réf. P4957
Primocin	InvivoGen, San Diego, Californie, États-Unis	Fourmi-PM-1, Fourmi-PM-2
filament monoclonal anti-alpha-synucléine de lapin	Abcam, Cambridge, Royaume-Uni	AB209538
Lapin monoclonal anti-phospha-sérine129-alpha-synucléine	Abcam, Cambridge, Royaume-Uni	AB51253
RCT Basic, agitateur magnétique IKA	IKA-Werke® GmbH, Staufen, Allemagne	Référence 3810000
facteur neurotrophique dérivé de la glie humaine recombinante (hGDNF)	PeproTech, Rocky Hill, NJ, États-Unis ou Prospec, Ness-Ziona, Israël	450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
fibrilles préformées (PFF) d’alpha-synucléine de souris recombinante	n/a	n/a	Don d’un collaborateur, Prof. Kelvin C Luk
Système de stéréomicroscope de recherche	Olympus Corporation, Tokyo, Japon	SZX10
mouton polyclonal anti-tyrosine hydroxylase	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Allemand	AB1542
TC 20 Compteur de cellules automatisé	BioRad Inc., Hercules, Californie, États-Unis	1450102
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	11332481001
trypsine	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, Chine	Référence 2199700