Préparation de plasma riche en plaquettes à partir de sang périphérique humain

Résumé

Cette vidéo montre la préparation d’un plasma riche en plaquettes (PRP) de haute qualité par le dépistage de la numération plaquettaire, la collecte et la centrifugation du sang et l’isolement des plaquettes. Ce PRP est utilisé dans des applications thérapeutiques pour la régénération et la cicatrisation des tissus.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Prélèvement d’échantillons

1. Dépistage des patients à l’aide de numérations sanguines préliminaires pour exclure une thrombocytopénie et établir des numérations cellulaires de base. Pour ce faire, utilisez un hémocytomètre de qualité clinique pour le comptage des cellules. Assurez-vous que le nombre de plaquettes est supérieur à 150 000 cellules/μL.

2. Assurez-vous que le patient est bien hydraté avant le prélèvement de l’échantillon. Cela pourrait être assuré par une inspection visuelle de la langue, une turgescence cutanée et une mesure de la pression artérielle.

3. Prélever 100 mL de sang veineux périphérique dans la veine antécubitale du patient à l’aide de 2 seringues de 50 mL remplies de 5 mL d’anticoagulant acide-citrate-dextrose-adénine (ACDA) dans un rapport de 1:10. Inclinez les seringues recueillies pour bien mélanger l’anticoagulant afin d’éviter la coagulation de l’échantillon de sang avant de passer à l’étape suivante.
   REMARQUE : Une prise de sang lente peut entraîner un mélange inadéquat du sang collecté avec l’anticoagulant et la coagulation ; par conséquent, utilisez une canule d’au moins 18G pour le prélèvement sanguin.

4. Transférez 100 ml de sang dans les seringues dans des tubes de centrifugation à fond conique de 15 ml avec 10 ml dans chaque tube.

2. Centrifugation et isolement

1. Placez les tubes de centrifugation dans une machine de centrifugation de table de qualité clinique maintenue à température ambiante dans un environnement stérile et exécutez l’essorage doux initial à la vitesse de 100 x g pendant 15 min. Le sang anticoagulé se sépare en trois couches, c’est-à-dire les globules rouges en bas, le plasma en haut et la couche chamois au milieu.

2. Pipetez la couche supérieure de l’échantillon à trois couches de manière stérile à l’aide d’une aiguille spinale stérile 18G et collectez-la dans un tube de centrifugation à fond conique séparé. Assurez-vous que des tubes individuels sont utilisés pour chaque 10 ml de plasma prélevé.
   REMARQUE : La décision d’inclure la couche leucocytaire dépend de la nature du plasma riche en plaquettes que nous essayons d’isoler, qui à son tour dépend de la nature de son application clinique. Si le PRP pauvre en leucocytes est le produit souhaité, abstenez-vous d’inclure la couche de couche leucocytaire, tandis que si le PRP riche en leucocytes est le produit souhaité, la couche supérieure de plasma ainsi que la couche leucocytaire sont pipetées pour le deuxième tour de centrifugation.

3. Soumettre le plasma collecté dans des tubes de centrifugation de 15 mL avec 10 mL de plasma chacun à une centrifugation par centrifugation par centrifugation à 1600 x g pendant 20 min. Les plaquettes présentes dans la pastille de plasma au fond du tube à essai. Recueillir le surnageant dans un tube séparé.

4. Pipetez la pastille plaquettaire dans une seringue de 5 ml à l’aide d’une aiguille spinale stérile de 18 g. Rassemblez tous les tubes à essai contenant des granules dans une seule seringue de 5 ml pour l’application.

5. Reconstituez la pastille recueillie avec des volumes suffisants pour une utilisation clinique avec le plasma surnageant dans le tube de centrifugation après le deuxième cycle de centrifugation.

3. Validation

1. Soumettre le PRP final préparé à la numération cellulaire à l’aide d’un hémacytomètre de qualité clinique pour calculer la numération plaquettaire et calculer la numération plaquettaire absolue dans le PRP, le gradient de concentration plaquettaire atteint par rapport à la ligne de base et l’efficacité de récupération plaquettaire du protocole à l’aide de la formule suivante.
   Numération plaquettaire absolue = numération plaquettaire du PRP en μL x 1000 x volume de PRP en mL
   Gradient de concentration plaquettaire =
   Efficacité de récupération plaquettaire =
   Par exemple, 100 ml de sang avec une numération plaquettaire de base de 200 000 / μL sont utilisés pour la préparation du PRP, et 5 mL de PRP avec une numération plaquettaire finale de 3 000 000 / μL sont obtenus. Les paramètres mentionnés ci-dessus sont calculés comme suit :
   Numération plaquettaire absolue = 3 000 000 x 1000 x 5 = 15 milliards de plaquettes
   Gradient de concentration plaquettaire = 3 000 000 / 200 000 = 15
   Efficacité de récupération plaquettaire = 3 000 000 x 1000 x 5 / 200 000 x 1000 x 100 = 75 %

2. Assurez l’efficacité de récupération du protocole par des cycles répétés. Un protocole efficace utilisé permet d’obtenir un gradient de concentration supérieur à 5 fois la valeur de base avec une efficacité de récupération de >80 %. En fonction de l’utilisation souhaitée du volume de PRP, le nombre de plaquettes qui doit être administré peut être ajusté en conséquence.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticoagulant Citrate Dextrose Solution IP	Fresenius Kabi, Inde	ACDAIP/L/A/19/00
BD Quincke Needle	Becton Dickinson, Espagne	405125	18G
Seringue DISPOVAN 50ml	Hindustan Serringes & Medical Devices Ltd, Inde
Seringue DISPOVAN 5ml	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, Inde
Spinwin Tube Conical Bottom Tarsons	, Inde	546021
Sysmex XN-350	Sysmex Inc., USA	XN 350
Machine de centrifugation clinique	de table REMI, Inde	R-8C	4x4 rotor pivotant