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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Dépistage de la présence de plaques colorées au méthoxy-X04
- À l’aide d’un atlas stéréotaxique du cerveau de souris, sélectionnez des sections de cerveau contenant la région d’intérêt, par exemple, l’hippocampe CA1 comme utilisé dans le présent exemple. Placez chaque section dans un puits à l’intérieur d’une plaque de culture de 24 puits contenant suffisamment de solution cryoprotectrice pour éviter que les sections ne se dessèchent.
- Examinez chaque section successivement pour éviter de les assécher en utilisant la procédure suivante :
- Ajoutez une gouttelette de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une lame de microscope avec une pipette jetable et placez la section sur la gouttelette.
- Examinez la coupe au microscope fluorescent pour identifier les régions contenant des plaques Aβ marquées au méthoxy-X04.
Remarque : le méthoxy-X04 peut être facilement visualisé à l’aide d’un filtre ultraviolet (UV) à fluorescence (excitation 340 - 380 nm).
- Capturez des images de régions d’intérêt (ROI) en fond clair ainsi qu’en mode fluorescence sans déplacer la platine du microscope, car chaque image doit montrer la même région dans les deux champs afin de corréler la présence des plaques directement à la région structurelle de la section de tissu.
- Enregistrez et nommez les images prises en fonction du numéro d’animal. Notez également le numéro du puits dans la plaque et le champ des photos prises. Par exemple, Ex : 9978A1B ; Numéro d’animal : 9978 ; Numéro de puits : A1 ; Champ : Brillant. Remettez la section dans son puits désigné une fois l’imagerie terminée.
Note : Au final, pour chaque section examinée, deux images sont obtenues, l’une en champ clair et l’autre en champ UV. - Ouvrez les deux images du même ROI (l’une en champ clair et l’autre en champ UV) dans l’image J, et à l’aide du plugin MosaicJ, alignez les bords des deux images et enregistrez l’image alignée et combinée en fonction du numéro de puits d’où elle provient.
- Enregistrez l’image dans un dossier séparé avec le numéro de l’animal en question. Combinez les images pour identifier et localiser les plaques dans la coupe tissulaire et avoir une vue complète de la section entière dans les deux champs différents (lumineux et UV).
- Une fois le processus de dépistage terminé, conservez les coupes examinées à -20 °C dans une plaque de culture à 24 puits contenant un cryoprotecteur jusqu’à ce qu’une immunocoloration ou un traitement ultérieur soit effectué.