Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Summary

Monocouches auto-assemblées (SAM) formé à partir de thiols à long alcane sur l'or de fournir des substrats bien définis pour la formation de motifs protéiques et de l'isolement cellulaire. D'impression par microcontact hexadecanethiol l'aide d'un polydiméthylsiloxane (PDMS) de timbre suivie par remblayage avec un glycol terminée alcane thiols monomère produit un modèle où les protéines et les cellules s'adsorbent seulement pour la région estampillé hexadecanethiol.

Abstract

Impression par microcontact fournit une méthode rapide, hautement reproductible pour la création de substrats motifs bien définis. ¹ Pendant l'impression par microcontact peut être employée pour imprimer directement un grand nombre de molécules, y compris les protéines, l'ADN ^{2, 3} et silanes, ⁴ la formation de l'auto -assemblés monocouches (SAM) de longues alcane thiols sur l'or offre un moyen simple de limiter les protéines et les cellules pour des modèles spécifiques contenant des régions adhésif et résistant. Ce confinement peut être utilisé pour contrôler la morphologie cellulaire et est utile pour l'examen d'une variété de questions en protéines et en biologie cellulaire. Ici, nous décrivons une méthode générale pour la création de motifs protéiques bien définis pour les études cellulaires ⁵ Ce processus comprend trois étapes:. La production d'un maître à motifs en utilisant la photolithographie, impression de la création d'un timbre en PDMS, et microcontact d'un or- substrat revêtu. Une fois modelée, ces substrats de culture de cellules sont capables de confiner les protéines et / ou de cellules (cellules primaires ou de lignées cellulaires) pour le motif.

L'utilisation de la chimie monocouche auto-assemblée permet un contrôle précis sur les régions à motifs adhésifs protéines / cellules et non-adhésive régions, ce qui ne peut être réalisée à l'aide d'emboutissage directe des protéines. Hexadecanethiol, la longue chaîne alcane thiols utilisés dans l'étape d'impression par microcontact, produit une surface hydrophobe qui adsorbe facilement protéines de la solution. Le glycol terminée par un thiol, utilisés pour le remblayage des régions non-imprimées du substrat, crée une monocouche qui est résistant à l'adsorption des protéines et donc la croissance cellulaire. ⁶ Ces monomères thiol produisent des monocouches hautement structurés qui définissent précisément les régions du substrat qui peuvent soutenir l'adsorption des protéines et la croissance cellulaire. En conséquence, ces substrats sont utiles pour une large variété d'applications de l'étude du comportement intercellulaire ⁷ à la création de la microélectronique. ⁸

Alors que d'autres types de chimie monocouche ont été utilisés pour des études de culture de cellules, y compris les travaux de notre groupe en utilisant trichlorosilanes pour créer des motifs directement sur ​​des substrats en verre, ⁹ monocouches à motifs formés à partir de thiols alcane sur l'or sont simples à préparer. Par ailleurs, les monomères utilisés pour la préparation monocouche sont disponibles dans le commerce, stable, et ne nécessitent pas de stockage ou la manipulation sous atmosphère inerte. Substrats préparés à partir de thiols Patterned alcane peuvent également être recyclés et réutilisés plusieurs fois, le maintien de l'isolement cellulaire. ¹⁰

Protocol

1. Préparation du Master motifs (figure 1)

1. Centre de la plaquette de silicium sur le spin-coucheuse et rincer la plaquette avec de l'acétone pendant l'étape initiale du programme de rotation en deux cycles dans le tableau 1. L'acétone va s'évaporer durant la deuxième étape du programme de tour en laissant un endroit propre, galette sèche.
2. Appliquer environ 1 mL AZ9245 photorésine / en (de diamètre) à la plaquette et de spin-coat en utilisant les conditions décrites dans le Tableau 1.
3. Soft-cuire la galette résine photosensible enduit à 110 ° C pendant 2 m en utilisant une plaque chauffante de haute uniformité.
4. Photopattern le s....

Discussion

Un certain nombre de questions peuvent surgir dans la production lithographique de maître utilisé pour la création de timbre de PDMS. Sous-exposition des résultats plaquette résister à revêtement dans les modèles flous et indistincts et la surexposition des résultats plaquette résister à revêtement en fonctionnalités élargie ou manquant. En général, les maîtres avec des tailles disposent de grandes (> 10 mm) sont relativement faciles à motif et se développer, alors que les maîtres avec de petites fonctionnalités peuv.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Plaquette de silicium	Wafer Reclaim services		2 pouce
Spin coucheuse / plaque chauffante	Brewer Science	Cee 200CB Spin-Cuire système
AZ9245 Photoresist	Mays Chemical Company	105880034-1160
Système de photolithographie à écriture directe	Microtech srl	LW325 Système LaserWriter
Masque de géométrie	HTG	3HR
Développeur 400K AZ	Mays Chemical Company	105880018-1160
Sylgard 182 Kit élastomère de silicone	Dow Corning
25 mm non. Une des lamelles en verre ronds	VWR	16004-310
Oxydant Plasma	Diener	Femto
Titane pièces Kamis	Incorporated		99,95%
Granules d'or	Kamis Incorporated		Pur à 99,999%
Par faisceau d'électrons d'évaporateur	Kurt J. Lesker	PVD 75 Système de dépôt de couches minces	avec des faisceaux d'électrons d'accessoires
Hexadecanethiol	Alfa Aesar	A11362
1-mercaptoundec-11-yl) tétra (éthylène glycol)	Sigma-Aldrich	674508
Éthanol	Pharmco-AAPER	111000200	200 preuve, absolue
Parafilm	VWR	52858-000
DPBS	VWR	4500-434	Sans calcium et de magnésium
Souris Laminine I	VWR	95036-762
La fibronectine de plasma humain	Invitrogen	33016-015
AlexaFluor ® 647 d'acide carboxylique, ester succinimidyle	Invitrogen	A-20006
Mitotracker Rouge 580	Invitrogen	M22425
AlexaFluor ® 350 carboxylique succinimidyle	Invitrogen	A-10168
Anti-laminine d'anticorps	Fisher Scientific	AB2034MI