Visualisation virus de la dengue grâce à Alexa Fluor Étiquetage

Summary

Profitant des avancées dans le développement de fluorophore et la technologie d'imagerie, une méthode simple de Alexa Fluor étiquetage des virus de la dengue a été conçu pour visualiser les interactions précoces entre le virus et la cellule.

Abstract

Les événements au début de l'interaction entre le virus et la cellule peut avoir une influence profonde sur l'issue de l'infection. Déterminer les facteurs qui influencent cette interaction pourrait conduire à une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie et ainsi influencer la conception de vaccin ou thérapeutiques. Ainsi, le développement de méthodes pour sonder cette interaction pourrait être utile. Les récents progrès dans le développement des fluorophores ^1-3 et la technologie d'imagerie ⁴ peut être exploitée pour améliorer nos connaissances actuelles sur la pathogénie de la dengue et d'ouvrir ainsi la voie pour réduire les millions de cas de dengue survenant chaque année.

Le virus de la dengue a enveloppé une externes échafaudage constitué de 90 glycoprotéine de l'enveloppe (E) dimères protégeant le réservoir nucléocapside, qui contient un seul brin ARN positif du génome ^5. Les sous-unités protéiques identiques sur la surface du virus peuvent donc être étiquetés avec un colorant amine réactive et visualisées par microscopie d'immunofluorescence. Ici, nous présentons une méthode simple de l'étiquetage des virus de la dengue avec Alexa Fluor succinimidyl ester colorant dissous directement dans un tampon bicarbonate de sodium qui a produit virus hautement viable après l'étiquetage. Il n'ya pas de procédure standardisée pour l'étiquetage des virus vivants et le protocole du fabricant existants pour l'étiquetage des protéines nécessite généralement la reconstitution de la teinture dans le diméthylsulfoxyde. La présence de diméthylsulfoxyde, même en quantités infimes, peut bloquer l'infection productive des virus et aussi induire ⁶ cytotoxicité cellulaire. L'exclusion de l'utilisation de diméthylsulfoxyde dans ce protocole ainsi réduit cette possibilité. Alexa Fluor colorants ont photostabilité supérieure et sont moins sensibles au pH que les colorants communs, tels que la fluorescéine et la rhodamine ^2, ce qui les rend idéales pour des études sur l'absorption cellulaire et le transport endosomal du virus. La conjugaison de Alexa Fluor colorant n'a pas d'incidence sur la reconnaissance du virus de la dengue labellisé par le virus de l'anticorps spécifique et de ses récepteurs putatifs en ⁷ cellules de l'hôte. Cette méthode pourrait avoir des applications utiles dans les études virologiques.

Protocol

1. Alexa Fluor étiquetage des virus de la dengue

1. Avant la réaction de marquage, de purifier virus de la dengue avec coussin de saccharose et de préparer les réactifs et les équipements nécessaires, comme indiqué dans le protocole.
2. Préparer une solution fraîche de tampon 0,2 M de bicarbonate de sodium, pH 8,5 (tampon de marquage), et 1,5 M de tampon d'hydroxylamine, pH 8,3 (arrêt réactif), juste avant l'étiquetage et stériliser par filtration avec des filtres seringue 0,2 um.
3. Diluez environ 3x10 ⁸ unités formant plaque (UFP) de virus purifié de dengue dans 1ml de tampon d'étiquetage dans un tube de 2 ml. Cela peut être étendue....

Discussion

Bien AF594 colorant a été utilisé dans ce rapport, une large gamme de fluorophores dans la série Alexa Fluor esters succinimidyle est disponible avec la chimie étiquetage similaire. Cela pourrait étendre l'application de l'étiquetage au-delà de l'imagerie. La cytométrie en flux peut être utilisé comme une alternative à la microscopie confocale pour estimer le degré d'étiquetage pour les fluorophores qui peuvent être excités et détectés par la machine FACS.

Alexa Fluor coloran.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Le bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich	S6297
Hydroxylamine	Sigma-Aldrich	159417
L'hydroxyde de sodium	Merck	106498
AF594 esters succinimidyle	Molecular Probes, Invitrogen	A20004
Colonne PD-10	GE Healthcare	17-0851-01
Hepes	Sigma-Aldrich	H6147
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
M-199	Invitrogen	11150
FBS	Hyclone	SH30070.03
4-même la plaque	Nunc	176740
Lamelles	Einst	0111520
Lame de microscope	Voile Marque	7105
3H5 hybridomes	ATCC	HB46
10x PBS	1er but	BUF-2040-10X1L
La saponine	Sigma-Aldrich	S4521
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Le chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	M2670
Le chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	C3306
Paraformaldehye	Sigma-Aldrich	15,812-7
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904
Dabco	Sigma-Aldrich	D27802
Centrifugeuse de table	Eppendorf	5424
Microscope confocal	Zeiss	LSM 710