Administration intranasale de cellules souches mésenchymateuses dans un modèle murin de lésion cérébrale traumatique

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Marquage des cellules souches mésenchymateuses (CSM) avec des nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétique (SPIO)

1. Pour marquer les CSM avec SPIO, ajoutez 6 mL de milieu de marquage (25 μg/mL de SPIO dans un milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) sans sérum de bovin fœtal (FBS)) dans une fiole T75 contenant des CSM (80 % de confluence).
2. Incuber les cellules avec le milieu de marquage dans un incubateur de CO₂ (37 °C, 5 % de CO₂ ) sans agiter. Après 24 h, retirez délicatement le support d’étiquetage à l’aide d’une pipette Pasteur stérile avec un embout en plastique fixé sous vide. Lavez les cellules monocouches 2x avec 6 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer toute trace de SPIO non internalisé.
   1. Pour déterminer si les cellules ont été marquées avec succès, vérifiez les cellules marquées au microscope fluorescent ou au microscope confocal si le SPIO est marqué avec un fluorophore (c’est-à-dire, comme ceux utilisés ici ; Figures 1B et C).
3. Récoltez les cellules adhérentes par traitement avec 3 mL de trypsine et incubez à 37 °C. Après 5 min d’incubation, ajouter 7 mL de milieu DMEM préchauffé avec 10 % de FBS (v/v) pour inactiver la trypsine. Prélever la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette dans un tube conique de 15 ml.
4. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans du PBS. Comptez les cellules viables à l’aide d’un colorant bleu trypan et d’un hémocytomètre.
   REMARQUE : La pastille cellulaire des cellules marquées apparaîtra de couleur foncée en raison de la charge en fer (Figure 1D). Ce protocole est pertinent pour le marquage des CSM et l’imagerie par résonance magnétique (IRM). La procédure de marquage des CSM a été optimisée auparavant, et seules les étapes de préparation des CSM marquées pour le suivi in vivo sont incluses ici, puisque le suivi in vivo est au centre de l’attention. Le protocole de culture et de marquage des autres types de cellules doit être optimisé par le chercheur.
5. Ajuster la concentration cellulaire à l’aide du PBS à 150 000 cellules (ou un nombre qui donne un signal IRM suffisant) dans 18 μL de PBS (ou le volume total qui sera utilisé dans la procédure d’administration intranasale).
   REMARQUE : Il a été remarqué qu’une concentration cellulaire supérieure à 150 000 cellules/18 μL de PBS conduit à l’agrégation cellulaire, ce qui peut affecter l’efficacité de l’administration intranasale. Si un nombre plus élevé de cellules est nécessaire pour l’administration intranasale, augmentez le volume total de suspension cellulaire et augmentez le nombre d’administrations intranasales, car l’administration intranasale est une procédure non invasive et des doses multiples sont possibles.

2. Blessure par impact cortical contrôlé (CCI)

REMARQUE : Dans ce protocole, les souris mâles C57 BL/6 (âgées de 7 à 8 semaines) ont été maintenues dans un cycle lumière/obscurité de 12/12 h avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau.

1. Pour préparer chaque souris à une lésion par CCI, administrer le cocktail anesthésique de zolazépam (50 mg/kg) et de xylazine (20 mg/kg) par injection intrapéritonéale (i.p.) (1 mL/kg). Assurez-vous que la profondeur de l’anesthésie est suffisante en évitant une réponse par pincement des orteils. Vous pouvez également placer la souris dans une chambre alimentée en isoflurane à 2 à 4 % pendant 60 s.
2. Rasez la fourrure de la surface dorsale du crâne entre les oreilles à l’aide d’une tondeuse à cheveux électronique. Nettoyez plusieurs fois la zone rasée à l’aide d’un coton-tige stérile imbibé d’iode. Utilisez un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 % pour éliminer l’iode.
3. Placez la souris anesthésiée dans le cadre stéréotaxique et fixez-la à l’aide de barres d’oreille et de nez. Faites une incision médio-sagittale (environ 2,5 cm) dans la peau rasée à l’aide de ciseaux stériles pour accéder à la surface du crâne.
4. Retirez le tissu de l’os à l’aide d’un coton pour exposer le crâne. Nettoyez la surface du crâne à l’aide d’un coton-tige imbibé de peroxyde d’hydrogène à 3 % (H₂O₂) pendant 10 s, puis nettoyez-la avec un coton sec.
   REMARQUE : Les sutures du crâne ainsi que le bregma et le lambda sont maintenant facilement identifiables.
5. Identifiez les coordonnées de choix à la surface du crâne pour la blessure de l’ICC et tracez un cercle (4 mm de diamètre) autour des coordonnées à l’aide d’un crayon ou d’un marqueur approprié.
   REMARQUE : Dans ce protocole, les coordonnées antéropostérieures (AP) -2,0 mm et médiolatérales (ML) +1,5 mm ont été utilisées pour l’induction de l’ICC.
6. À l’aide d’une microperceuse et d’une fraise ronde (0,5 mm de diamètre), éclaircissez le crâne au niveau du cercle marqué. Évitez d’appliquer une pression pendant le forage, car le forage à travers l’os peut endommager le parenchyme cérébral. Nettoyez la poussière d’os à l’aide d’un coton-tige propre et sec.
7. Retirez délicatement le lambeau osseux à l’aide d’une pince fine stérile pour exposer la dure-mère tout en la gardant intacte. Retirez la souris du cadre stéréotaxique qui a été utilisé pour la préparation avant la blessure et placez-la dans le cadre stéréotaxique de l’appareil CCI.
8. Stabilisez la tête de la souris à l’aide des barres d’oreille et des barres nasales. Assurez-vous que la tête de la souris est de niveau dans le sens rostral-caudal et ajustez les barres nasales, si nécessaire.
9. Suivez les instructions sur le boîtier de commande pour mettre l’extrémité de l’impacteur à zéro sur la surface corticale exposée. Assurez-vous que l’extrémité de l’impacteur est alignée directement au-dessus des coordonnées du cortex souhaité pour être impacté à l’aide des roues de commande X et Y à la base de l’impacteur.
10. Réglez les paramètres de l’expérience à l’aide du boîtier de commande avec une vitesse de 5 m/s, un temps de séjour de 250 ms et une profondeur de blessure de 1 mm pour induire des blessures légères chez la souris.
11. Provoquez des blessures en appuyant sur le bouton ''impact'' sur le boîtier de commande. Écouvillonnez tout saignement qui se produit à l’aide d’un coton-tige stérile.
12. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et fermez l’incision à l’aide de sutures chirurgicales en soie. N’utilisez pas de clips métalliques pour fermer le site chirurgical, car la souris sera soumise à un champ magnétique pour l’IRM.
13. Appliquez des antibiotiques topiques (bacitracine, néomycine) sur le site chirurgical pour prévenir les infections. Gardez la souris sur le coussin chauffant et surveillez-le de près pendant la phase de récupération.
14. Administrer du kétoprofène (2,5 mg/kg, IP) quotidiennement pendant 3 jours après la chirurgie, à moins que l’administration de kétoprofène ne contredit les objectifs de l’étude.

3. Administration intranasale

1. À 1 jour après l’induction de l’ICC, administrer le cocktail anesthésiant de zolazépam (50 mg/kg) et de xylazine (20 mg/kg) par injection intraveineuse. Assurez-vous que la souris est profondément anesthésiée par l’absence de réponse par pincement des orteils.
2. Préparez la souris à l’administration intranasale de CSM par traitement à l’hyaluronidase.
   1. Attrape la peau de la souris et tourne-la fermement sur le dos tout en immobilisant le crâne. Placez l’extrémité d’une pipette contenant de l’hyaluronidase dans du PBS stérile (4 U/μL) près de la narine de la souris à un angle de 45°.
   2. Administrer 3 μL de suspension d’hyaluronidase dans chaque narine. Gardez la souris immobilisée et tournée vers le haut sur un tapis propre pendant 5 min. Répéter le traitement à l’hyaluronidase 4x (total de 100 U de suspension d’hyaluronidase).
3. Après le traitement à l’hyaluronidase, gardez la souris traitée sur un tampon propre vers le haut pendant 30 min.
4. Pour délivrer des CSM dans le cerveau, tenez fermement la souris, comme décrit à l’étape 3.2.1. Administrer 3 μL/narine de suspension MSC avec un intervalle de 3 s. Maintenez la souris dans la même position pendant 30 s jusqu’à ce que les gouttes d’échantillon aient complètement disparu.
   REMARQUE : Évitez de former des bulles d’air pendant l’administration.
5. Répétez l’administration avec un intervalle de 2 minutes jusqu’à 3x.
   REMARQUE : Le nombre total de cellules à délivrer est de 150 000, de sorte que 18 μL de la suspension cellulaire peuvent être administrés à une dose de 3 μL pour chaque narine, 3x chacune.
6. Remettez la souris dans sa cage et surveillez-la de près jusqu’à ce qu’elle se remette complètement de l’anesthésie.

Figure 1 : Organigramme schématique du protocole et confirmation in vitro de l’adoption de SPIO par les MSC. (A) Les CSM ont été incubées avec SPIO pendant 24 heures pour le marquage. Ensuite, les CSM marquées ont été introduites dans un modèle de souris TBI par voie intranasale (IN). L’IRM a été réalisée à différents moments pour suivre les CSM marquées. La confirmation d’un marquage suffisant des CSM par SPIO a été obtenue par (B) la microscopie à fluorescence et (C) la microscopie confocale en utilisant le canal FITC puisque les nanoparticules SPIO ont été marquées avec FITC. (D) La pastille cellulaire des CSM marquées est apparue de couleur foncée en raison de la charge en fer. FITC = isothiocyanate de fluorescéine ; SPIO = particules superparamagnétiques d’oxyde de fer ; CSM = cellules souches mésenchymateuses ; IRM = imagerie par résonance magnétique ; IN = intranasale ; TCC = traumatisme crânien.