Une méthode pour développer des cellules T γδ à partir des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) est décrite. PBMC dérivés des lymphocytes T γδ sont stimulés et étendu en utilisant le zolédronate et l'interleukine-2 (IL-2). L'expansion à grande échelle de cellules T γδ peuvent être appliquées à l'immunothérapie cellulaire autologue de cancer.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Expansion du sang périphérique humain cellules T γδ utilisant zolédronate
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'homme des cellules T γδ peuvent reconnaître et répondre à une grande variété de stress induit par les antigènes, développant ainsi une large activité innée anti-tumorale et anti-infectieux. 1 La majorité des cellules T γδ dans le sang périphérique ont le récepteur des cellules T Vγ9Vδ2. Ces cellules reconnaissent un antigène dans un complexe d'histocompatibilité majeure manière indépendante et de développer de solides cytolytique et Th1-like fonctions effectrices. 1 Par conséquent, γδ lymphocytes T sont des cellules effectrices candidat intéressant pour l'immunothérapie du cancer. Vγ9Vδ2 cellules T de répondre à phosphoantigènes tel que (E)-4-hydroxy-3-méthyl-but-2-ényle pyrophosphate (HMBPP), ce qui est synthétisée dans la bactérie via la biosynthèse des isoprénoïdes; 2 et isopentényl pyrophosphate (IPP), qui est produite dans les cellules eucaryotes par la voie du mévalonate. 3 Dans l'état physiologique, la génération des IPP dans la cellule non transformée n'est pas suffisant pour l'activation des cellules T γδ. Le dérèglement de voie du mévalonate dans les cellules tumorales conduit à l'accumulation des IPP et γδ lymphocytes T d'activation. 3 Parce aminobisphosphonates (comme le pamidronate ou zolédronate) inhibent farnésyl pyrophosphate synthase (FPPS), l'enzyme agissant en aval de la PIP dans la voie du mévalonate, les taux intracellulaires de IPP et sensitibity aux cellules T γδ reconnaissance peut être thérapeutique augmenté de aminobisphosphonates. IPP accumulation est moins efficace dans les cellules nontransfomred que des cellules tumorales avec une concentration pharmacologiquement pertinentes de aminobisphosphonates, qui nous permettent d'immunothérapie pour le cancer en activant les cellules T γδ avec aminobisphosphonates 4. Fait intéressant, IPP s'accumule dans les monocytes lors PBMC sont traitées avec aminobisphosphonates, en raison de l'efficacité l'absorption des médicaments par ces cellules. 5 monocytes qui s'accumulent IPP deviennent cellules présentatrices d'antigène et stimuler Vγ9Vδ2 cellules T dans le sang périphérique. 6 Basé sur ces mécanismes, nous avons développé une technique à grande échelle l'expansion des cultures de cellules T γδ utilisant zolédronate et l'interleukine -2 (IL-2). 7 D'autres méthodes pour l'expansion des cellules T γδ utiliser le pyrophosphate bromhydrine synthétiques phosphoantigènes (BrHPP) 8 ou 2-méthyl-3-butényle-1-pyrophosphate (2M3B1PP) 9. Toutes ces méthodes permettent ex l'expansion in vivo, ce qui entraîne un grand nombre de cellules T γδ pour une utilisation en immunothérapie adoptive. Toutefois, seul le zolédronate est un réactif approuvé par la FDA disponible commercialement. Zolédronate-élargi γδ lymphocytes T CD27 écran - CD45RA - phénotype mémoire effecteurs et leur fonction peut être évaluée par l'IFN-γ test de production 7.
Protocole
1. Isolation des PBMC
- Prélever le sang (7,5 à 8,0 ml) dans un tube BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec de l'héparine de sodium. Le tube contient un anticoagulant héparine sodique et d'un fluide de densité Ficoll-Hypaque, plus une barrière de gel de polyester, qui sépare les deux liquides. Centrifuger le tube / échantillon de sang à température ambiante (18 ° C à 25 ° C) dans un rotor horizontal (swing-out tête) pendant 20 min à 1800 x g. Commutateur centrifugeuse freins hors tension.
- Après centrifugation, la séquence de couches se produit comme suit (vu de haut en bas): un plasma) - b) les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et plaquettes - c) la solution de densité - gel de polyester d) - e) les granulocytes - f) globules rouges (fig. 1).
- Recueillir une fraction de la couche de plasma, en laissant 5 à 10 mm de plasma au-dessus de l'interphase sans déranger la couche de cellules. Le plasma peut être utilisé pour la culture (article 2.5).
- Récolte de la fraction enrichie (PBMC) à l'interphase avec une pipette et transférer dans un tube de 15 ml conique.
- Laver les PBMC avec 10 ml de tampon phosphate salin (PBS), en inversant le tube 5 fois, puis centrifuger 5 min à 400 x g.
- Répétez les étapes de lavage à deux reprises, puis remise en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de PBS. Déterminer le nombre de cellules. Habituellement 1,3 x10 6 cellules sont récupérées à partir de 1 ml de sang total.
- Déterminer la fréquence et le phénotype des cellules γδ T PBMC par cytométrie en flux (section 3) (Fig. 2).
2. L'expansion des cellules T γδ
- Centrifugeuse suspensions cellulaires dans 15 ml tubes coniques pendant 5 min à 400 x g à température ambiante, et jeter le surnageant.
- Préparer un milieu de culture (CM) en ajoutant l'IL-2 humaine (IL-2) et le zolédronate (Zometa) à des concentrations finales de 1000 UI / ml et 5 uM, respectivement. ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) ou OpTmizer (Invitrogen) des médias de soutenir l'expansion des cellules T bonnes γδ (plus d'informations dans les références 6 et 9). Zometa est fourni sous forme liquide (4 flacon mg/5-ml). Pour préparer une solution à 5 uM, ajouter 50 ul de Zometa à 30 ml de milieu de culture.
- Resuspendre le culot cellulaire dans un milieu de culture et de s'adapter à 1x10 6 cellules / ml.
- Pipeter 1 ml de CM contenant 1x10 6 cellules dans chaque puits d'une plaque de 24 puits. Pour les grandes cultures, les cellules peuvent être ensemencées à 0,5 x 10 6 cellules / cm 2 selon la surface du puits de la plaque, plat, ou le flacon.
- Ajouter plasma autologue (section 1.3), regroupés AB humain sérums ou FCS pour qu'il se trouve à environ 10% du volume de la culture (100 pi pour chaque puits d'une plaque de 24 puits). Placer les plaques dans un 37 humidifié ° C, 5% de CO 2 incubateur de 24-48 heures.
- Maintenir la culture à une densité cellulaire de 0,5-2 x 10 6 cellules / ml. Ajouter un milieu frais contenant l'IL-2 humaine (1000 UI / ml) seule (sans Zometa) tous les 2-3 jours, et le transfert des cellules cultivées dans des puits nouveaux ou flacons que nécessaire, selon le degré de prolifération cellulaire (Fig. 3). Plasmatique d'alimentation ou de sérum dans le milieu de sorte que la concentration sérique peut être maintenu au moins 1%.
- Récolte des cellules le jour 12-14 et déterminer la fréquence, le phénotype et les fonctions des cellules T γδ par cytométrie en flux (voir ci-dessous).
3. L'analyse phénotypique par cytométrie en flux
- Transfert de 200 échantillons ul contenant 2 x 10 5 cellules pour le tri de cellules activées par fluorescence (FACS) tubes.
- Ajouter 2 ml de PBS froid et centrifuger 5 min à 400 x g. Ensuite, remettre en suspension les boulettes dans 50 ul de tampon FACS (PBS + 1% de FCS azoture de sodium + 0,1%). Ajouter 5 ul de chaque anticorps pour les échantillons (les anticorps monoclonaux sont énumérés dans le tableau 1).
- Incuber sur de la glace dans l'obscurité pendant 20 min.
- Ajouter 2 ml de tampon FACS à chaque échantillon, puis de vortex. Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 400 x g à 4 ° C. Décanter avec précaution le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans 300 ul de tampon FACS et les vortex. Analyser des échantillons sur un cytomètre en flux (Fig. 2).
4. IFN-γ test de production 10
- Le jour avant le dosage, préparer des cellules stimulatrices en cultivant 3-5 cellules Daudi x10 5 / ml dans du milieu RPMI 1640 plus 10% de FCS (RPMI-10) pendant la nuit avec Zometa (5 uM) (ci-après désignée Z-Daudi).
- Recueillir Z-Daudi et remettre en suspension dans du RPMI-10 à 2x10 6 cellules / ml. Ajouter 100 ul de Z-Daudi (2x10 5) à chaque puits d'une plaque à fond rond de 96 puits.
- Préparer les cellules T γδ au 2x10 6 cellules / ml dans du RPMI-10 contenant Bréfeldine A à 20 pg / ml. Transférer 100 ul de suspension cellulaire T γδ (2x10 5) à chaque puits contenant les cellules Daudi-Z ou de contrôler des puits (100 pl de RPMI-10 seulement, ou RPMI-10 avec 20 ng / ml de phorbol 12-myristate 13-acétate[PMA] et 2 pg / ml d'ionomycine).
- Mélanger à la pipette et à plusieurs reprises. Incuber pendant 4 heures dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
- Centrifuger la plaque pendant 5 min à 400 x g à 4 ° C et remettre les boulettes dans 200 ul de PBS froid.
- Transférer les échantillons dans des tubes FACS. Ajouter 4 ml de PBS froid et centrifuger les tubes pendant 5 min à 400 x g à 4 ° C.
- Resuspendre les culots dans 50 ul de tampon FACS avec FITC conjugué anti-TCRVγ9 (5 pi) et de PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 pi). Incuber abri de la lumière pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter 100 ul de réactif IntraPrep 1 et incuber pendant 15 min à température ambiante. Ajouter 4 ml de PBS dans chaque tube et centrifuger 5 min à 400 x g à température ambiante.
- Retirer le surnageant par aspiration et ajouter 100 l de réactif 2 IntraPrep. Incuber pendant 5 min à température ambiante sans agitation.
- Ajouter 5 ul de PE-conjugué anti-IFN-γ mAb le tube à essai. Incuber abri de la lumière pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter 4 ml de PBS dans chaque tube et centrifuger 5 min à 400 x g à température ambiante. Retirer le surnageant par aspiration et resuspendre le culot cellulaire dans 0,5 ml de tampon FACS.
- Analyser les cellules par cytométrie en flux. Porte sur le CD3 + + TCRVγ9 cellules et d'examiner l'expression d'IFN-γ (Fig. 4).
5. Les résultats représentatifs:
Il est important de déterminer le pourcentage de cellules T γδ dans PBMC à l'initiation de la culture. Comme le montre la Fig. 2 A, le pourcentage de cellules CD3 + + TCRVγ9 γδ lymphocytes T dans les PBMC a été de 1,6% au jour 0. Les populations dominantes étaient CD27 + CD45RA + CD27 + naïfs ou CD45RA - phénotypes mémoire centrale. Lorsque les cellules T γδ ont été stimulés efficacement, ils ont formé des grappes sur les jours 3-5 (Fig. 3 A et B). Lorsque la formation de grappes a été retardée, la croissance des autres types cellulaires, comme les cellules CD4 + ou CD8 + αβ des cellules T ou des cellules NK pourrait dominer la croissance des cellules T γδ (Fig. 3 C et D). Après 14 jours de culture, de la fréquence des cellules T γδ augmenté à plus de 93,8% des cellules cultivées dans des cultures de cellules γδ réussie T (fig. 2 E). La culture des cellules T γδ surexprimés NKG2D et expression de CD69 (fig. 2 G et H). Ils s'affichent CD27 - CD45RA - phénotype mémoire effecteurs (Fig. 2 F). Les fonctions des cellules T γδ ont été évalués à l'égard de la production de cytokines et la cytotoxicité. L'IFN-γ intracellulaire coloration démontré que les cellules T γδ IFN-γ produit en réponse au PMA / ionomycine traitement ou Z-Daudi cellules qui IPP accumulés après le traitement zolédronate (fig. 4). Ces résultats indiquent que le zolédronate peut efficacement stimuler et de développer des cellules T γδ fonctionnelle.
| Tube | FITC | PE | DPE | PE/Cy5 |
| 1 | CD3 | CD19 | CD45 | CD14 |
| 2 | CD3 | TCRap | CD4 | CD8 |
| 3 | CD3 | CD56 | ||
| 4 | TCR Vy9 | TCRap | CD45 | CD3 |
| 5 | TCR Vy9 | NKG2D | ||
| 6 | TCR Vy9 | CD69 | ||
| 7 | TCR Vy9 | IgG1 de souris | ||
| 8 | TCR Vy9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCR Vy9 | IgG1 de souris | IgG1 de souris |
Tableau 1. Les anticorps monoclonaux utilisés dans la coloration des cellules T multicolores γδ. Un exemple de l'analyse phénotypique des cellules T γδ effectué dans notre laboratoire est montré dans la Fig. 2.
Figure 1. Séparation des PBMC. Sang (7,5 à 8,0 ml) est tiré dans un tube BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec de l'héparine de sodium et directement centrifugé pendant 20 min à 1800 x g. Après centrifugation, les couches résultant comme on le voit du haut vers le boTTOM: un écran plasma) - b) PBMC et plaquettes - solution de densité c) - gel de polyester d) - e) Granulocytes - f) Les globules rouges.
Figure 2. Phénotype de surface typiques des cellules T γδ. PBMC ont été stimulées avec le zolédronate et IL-2 pendant 14 jours. Les cellules ont été colorés avec marqué FITC anti-TCR Vy9 et PE/Cy5-labeled anti-CD3 pour surveiller l'expansion des cellules T γδ (A et E). Les cellules T γδ ont été identifiés par leur expression de TCRVγ9, et leur expression de CD27 et CD45RA (B et F), NKG2D (C et G), ou CD69 (D et H) a été examiné.
Figure 3. Représentant γδ cultures de cellules T. PBMC ont été stimulées par l'IL-2 (1000 UI / ml) et le zolédronate (5 um). Champs représentatifs sont présentés (IX71 microscope inversé [Olympus] x 200). Les clusters et les agrégats de cellules T γδ peuvent être observés au jour 3 (A) et le jour 5 (B), lorsque les cellules T γδ ont été développé avec succès. En revanche, aucun amas ou d'agrégats ont été observés lorsque la croissance des cellules T γδ n'était pas adéquate (C et D).
Figure 4. IFN-γ production. Les cellules T γδ ont été incubées avec du RPMI-10 seulement (A) ou PMA / ionomycine (B) ou Z-Daudi (C) pendant 4 heures. Tout d'abord, l'expression de surface de TCRVγ9 était tachée et ensuite de l'IFN-γ de production a été examiné par l'IFN-γ intracellulaire coloration.
Figure 5. Cinétique de la culture de cellules γδ T. (A) Le nombre absolu de cellules cultivées, (B) le pourcentage de cellules T γδ, et (C) le nombre absolu de lymphocytes T γδ dans les points de temps indiqués.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La méthode présentée ici permet l'expansion efficace des cellules T γδ partir des PBMC. γδ cellules T activées et élargies par le zolédronate et IL-2 développent complète des fonctions effectrices, reflétée par la production de cytokines et la cytotoxicité. Il a été rapporté que le pyrophosphate bromhydrine synthétiques phosphoantigènes (BrHPP) et le 2-méthyl-3-butényle-1-pyrophosphate (2M3B1PP) élargira également les cellules T γδ, mais ils ne sont pas disponibles dans le commerce. En revanche, le zolédronate est d...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| ZOMETA | Novartis Pharma K. K | zolédronate | |
| PROLEUKIN | Novartis Pharmaceuticals | IL-2 humaine recombinante | |
| BD Vacutainer CPT Tube Préparation des cellules avec de l'héparine de sodium | BD | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203 moyennes | Cellule Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| Un bréfeldine | Sigma | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) | Sigma | P1585-1MG | |
| ionomycine | Sigma | 13909-1ML | |
| IntraPrep | BECKMAN COULTER | A07803 | |
| anti-humain CD3-FITC ou PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| anti-CD4 humain DPE | BECKMAN COULTER | 6604727 | |
| anti-humain CD8-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | 6607011 | |
| anti-humain CD14-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07765 | |
| anti-humain CD19-PE | BECKMAN COULTER | A07769 | |
| anti-humain CD45-ECD | BECKMAN COULTER | A07784 | |
| anti-humain CD56-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07789 | |
| anti-humain TCRap-PE | BECKMAN COULTER | A39499 | |
| TCR anti-humaine-FITC Vy9 | BECKMAN COULTER | IM1463 | |
| anti-humain CD27-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | 6607107 | |
| anti-humain CD45RA-DPE | BECKMAN COULTER | IM2711 | |
| anti-humain CD69-PE | BD | 555531 | |
| anti-humain NKG2D-PE | BECKMAN COULTER | A08934 | |
| Anti-humal IFN-PE | BECKMAN COULTER | IM2717U | |
| Souris IgG1 isotype contrôle-PE | BECKMAN COULTER | A07796 | |
| Souris IgG1 isotype contrôle-ECD ou PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07797 A07798 |
Références
- Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
Étiquettes
Cellules T gamma deltaexpansion au zolédronatecellules mononucléées du sang périphériqueanalyse par cytométrie en fluxcentrifugation sur gradient de densitéstimulation à l'interleukine-2cellules présentatrices d'antigènephénotype mémoire effectriceinterféron gamma intracellulairepréparation de qualité clinique
