Administration ciblée de substances au cerveau de la souris par perfusion dans l’artère carotide interne

Résumé

Source : Leda, A. R., et al. Technique de perfusion de microchirurgie chez la souris pour l’administration ciblée de substances dans le SNC via l’artère carotide interne. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo présente une procédure microchirurgicale conçue pour faciliter la perfusion ciblée d’une substance testée dans le cerveau via l’artère carotide interne (ICA). La procédure implique une suture précise et une manipulation vasculaire pour restreindre temporairement le flux sanguin, assurant ainsi une livraison contrôlée. Un tube capillaire est inséré dans l’artère carotide externe (ECA) et avancé vers la bifurcation. Lors de la perfusion, la substance contourne la circulation systémique, traverse la barrière hémato-encéphalique et parvient à une administration ciblée au parenchyme cérébral.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des souris pour la chirurgie

1. Anesthésie la souris avec de l’isoflurane mélangé à de l’oxygène, à l’aide d’un système d’anesthésie de laboratoire. Utilisez l’isoflurane à un réglage compris entre 4 et 5 % et un débit d’oxygène de 2 L/min sur la machine commerciale (voir le tableau des matériaux). Transférez l’animal sur la surface de la chirurgie, sous un stéréomicroscope, et maintenez l’anesthésie à l’aide d’un cône nasal (utilisez un réglage d’isoflurane de 1,5 à 2,5 et un débit d’oxygène de 2 L/min).
   1. Assurez-vous que la fréquence respiratoire de la souris est d’environ 1 à 2 respirations/s sans haleter. De plus, assurez-vous que l’animal ne présente pas de moustaches, de réaction de stimulation et de réflexe de pédale (pincement des orteils). Surveiller la fréquence respiratoire et l’effort pendant la chirurgie, au moins toutes les 5 minutes. Suivre les directives spécifiques du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux et des vétérinaires pour la surveillance de l’anesthésie des rongeurs.
2. Appliquez une goutte de lubrifiant ophtalmique sur chaque œil à l’aide d’un écouvillon stérile afin d’éviter le dessèchement. L’administration d’anti-inflammatoires et d’analgésiques pour soulager l’inconfort est recommandée.
3. Avec l’animal allongé sur le dos, maintenez l’anesthésie à l’aide d’un cône nasal.
4. Nettoyez la zone du cou de l’animal en l’essuyant trois fois avec de l’éthanol à 70 % et de la chlorhexidine. Rasez la zone chirurgicale de l’animal à l’aide d’un rasoir (détaillé ci-dessous).

2. Dissection de l’artère carotide commune (ACC)

1. Effectuez l’ensemble de la procédure de microchirurgie sous un stéréomicroscope. À l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces, effectuez une incision médiane peu profonde dans le cou, du dessus du sternum jusqu’en dessous de la mâchoire (environ 3 à 4 cm).
2. À l’aide d’une pince, séparez soigneusement le tissu adipeux et conjonctif pour exposer la trachée.
3. Placez un oreiller (objet rond, d’environ 0,5 cm de diamètre) à l’arrière du cou de la souris pour étendre le cou et exposer davantage la zone.
4. Séparez les tissus à l’aide d’un écarteur de tissus ou de crochets.
5. Sur le côté gauche de la trachée de l’animal, épilez soigneusement le tissu conjonctif pour exposer l’ACC gauche.
6. À l’aide d’une pince, on retire soigneusement tout le tissu conjonctif pour exposer la bifurcation de l’ACC et le début des artères carotides externes et internes.

3. Préparation de l’ACC pour la perfusion de la substance

1. Insérez deux segments de suture en nylon (environ 1 cm chacun) sous l’artère carotide externe (ECA), à l’aide d’une pince.
2. Placez un nœud permanent au point le plus haut possible de l’ECA.
3. Au point le plus bas possible de l’ECA, immédiatement au-dessus de la bifurcation de l’ACC, placez un nœud amovible. Ce nœud doit être lâche par rapport au nœud supérieur.
4. Fermez le CCA à l’aide d’une pince de récipient, au point le plus bas possible.
5. Fermez l’artère carotide interne (ICA) à l’aide d’un clip vasculaire.
6. À l’aide de ciseaux à ressort de microdissection, effectuez une petite coupe dans l’ECA (environ 2 mm), entre les deux nœuds.

4. Perfusion de substance via ICA

1. Assemblez un système de perfusion. Fixez 6 pouces de tube capillaire (dimensions idéales : 2,5 mm x 1,2 mm) à une seringue à tuberculine contenant 250 μl de la substance à perfuser (médicaments, agents pathogènes, vésicules extracellulaires, entre autres) et insérez doucement l’embout capillaire dans l’incision pratiquée à l’étape 3.6.
2. Continuez à glisser le long du capillaire jusqu’à ce qu’il atteigne un point médian entre la bifurcation et le clip fermant le CCA.
3. Attachez le nœud ECA inférieur. Vérifiez que le nœud est suffisamment lâche pour permettre la fluidité capillaire et suffisamment serré pour éviter les fuites.
4. Retirez le clip de l’ICA.
5. Appliquez doucement une pression sur le piston de la seringue pour permettre une perfusion de la substance à environ 10 μl par seconde.

5. Procédures post-perfusion Replacez

1. le clip sur l’ICA.
2. Retirez délicatement le tube capillaire.
3. Attachez complètement le nœud ECA inférieur.
4. Retirez les clips de l’ICA et du CCA.

6. Fermeture de l’incision et soins postopératoires

1. Retirez l’écarteur ou les crochets en tissu et l’oreiller.
2. Nettoyez la zone de suture à l’aide d’une solution saline stérile.
3. Fermez l’incision à l’aide d’une suture/aiguille en nylon et d’une pince.
4. Administrer des anti-inflammatoires et des analgésiques pour soulager l’inconfort postopératoire.
5. Placez l’animal dans une cage placée sur un coussin chauffant pendant au moins 1 heure et surveillez la récupération.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Instrument d’anesthésie	Vetequip	901806
Ciseaux chirurgicaux	Fine Science Tool	14558-09
Pince chirurgicale à pointe droite	Fine Science Tool	00108-11
Pince chirurgicale à pointe coudée	Fine Science Tool	00109-11
Ciseaux à ressort	Fine Science Tool	15000-08
Suture en nylon	Braintree Scientific	SUT-S 104
Tube capillaire (Micro-Renathane 0,010 » x 0,005 » par pi)	Braintree Scientific	MRE01050
Suture fermante	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-triphényltétrazolium	FisherScientific	50-121-8005

Chlorure de