Génération expérimentale de carcinome Associated fibroblastes (CAF) à partir des fibroblastes mammaires

Résumé

Carcinome associé fibroblastes (CAF) riche en myofibroblastes présents dans le stroma tumoral, jouent un rôle majeur dans la conduite progression tumorale. Nous avons développé un modèle xengraft coimplantation tumeur pour générer expérimentalement CAF à partir de fibroblastes humains mammaires. Le protocole décrit comment établir myofibroblastes CAF qui acquièrent une capacité de promouvoir la tumorigenèse.

Résumé

Les carcinomes sont des tissus complexes composé de cellules néoplasiques et d'un compartiment non cancéreuse appelée la «stroma». Le stroma est constitué d'une matrice extracellulaire (MEC) et une variété de cellules mésenchymateuses, y compris les fibroblastes, les myofibroblastes, cellules endothéliales, les péricytes et les leucocytes ^1-3.

Le stroma tumoral associé est sensible aux signaux paracrines importante libérée par les cellules de carcinome voisins. Pendant le processus de la maladie, le stroma devient souvent peuplées par un carcinome associé fibroblastes (CAF), y compris un grand nombre de myofibroblastes. Ces cellules ont déjà été extraits de nombreux types de cancers humains in vitro pour leur culture en. Une sous-population des CAF se distingue grâce à leur régulation à la hausse de l'actine musculaire lisse α (α-SMA) l'expression ^4,5. Ces cellules sont une caractéristique de «fibroblastes activés» qui partagent des propriétés similaires aux myofibroblastes commonly observée dans les tissus blessés et fibrotiques ^6. La présence de ce sous-ensemble myofibroblastique CAF est fortement liée à la haute qualité des tumeurs malignes et associé à un mauvais pronostic chez les patients.

Beaucoup de laboratoires, y compris la nôtre, ont montré que les CAF, lorsqu'il est injecté avec des cellules de carcinome dans des souris immunodéficientes, sont capables de promouvoir la tumorigenèse nettement ^7-10. CAF préparés à partir de patients atteints de cancer, cependant, subissent fréquemment la sénescence cours de la propagation de la culture en limitant l'ampleur de leur utilisation à travers l'expérimentation en cours. Pour surmonter cette difficulté, nous avons développé une nouvelle technique pour générer des expérimentalement humaines immortalisées lignées cellulaires mammaires CAF (exp-CAF) à partir de fibroblastes humains mammaires, en utilisant un sein coimplantation xénogreffes de tumeurs du modèle.

Afin de générer exp-CAF, des parents humains fibroblastes mammaires, obtenues à partir des tissus mammoplastie de réduction, ont d'abord été immortalised avec hTERT, la sous-unité catalytique de l'holoenzyme télomérase, et pour exprimer la GFP et un gène de résistance puromycine. Ces cellules ont été coimplanted avec MCF-7 des cellules de carcinome du sein exprimant un oncogène ras activé (MCF-7-ras cellules) dans une xénogreffe de souris. Après une période d'incubation in vivo, les fibroblastes humains initialement injecté mammaires ont été extraites des xénogreffes de tumeur sur la base de leur résistance à la puromycine ^11.

Nous avons observé que le résident des fibroblastes mammaires se sont différenciées, en adoptant un phénotype tumoral myofibroblastique et acquis des propriétés favorisant au cours de la progression tumorale. Fait important, ces cellules, définie comme exp-CAF, imitent le phénotype tumoral de promotion de la CAF myofibroblastique isolées de cancers du sein chez des patients disséqués. Notre tumeur xénogreffe dérivés exp-CAF donc fournir un modèle efficace pour étudier la biologie de la CAF dans les Breas humainecarcinomes t. Le protocole décrit peut également être étendue pour générer et caractériser les différentes populations CAF provenant d'autres types de carcinomes humains.

Protocole

1. L'isolement des cultures primaires de fibroblastes humains normaux mammaires

Les procédures expérimentales permettant d'isoler cultures primaires de fibroblastes humains normaux mammaires sont décrites dans la Fig. 1A.

1. Préparer le tampon de dissociation cellulaire, comme décrit précédemment ^12: Medium Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% sérum de veau foetal (FCS), de pénicilline-streptomycine (200 unités / ml), la collagénase de type I (1 mg / ml) et de l'hyaluronidase ( 125 unités / ml).
2. Laver le tissu mammaire disséqué d'une réduction mammaire (~ 0,5 gramme) à plusieurs reprises dans un tampon p....

Discussion

Le manque de marqueurs spécifiques CAF et le niveau d'hétérogénéité observée entre les CAF rendent la caractérisation de ce type de cellule un défi en soi. CAF étudier in vitro a également été entravée par la complication supplémentaire que ces cellules sénescentes et arrêter la prolifération lorsqu'elles sont cultivées pendant une longue période. Notre tentative précédente pour immortaliser directement CAF primaires en utilisant une construction hTERT rétroviraux ADNc a été infructueuse. Par c.......

Matériaux

Nom du produit	Tapez	Société	Numéro de catalogue	Commentaire
DMEM		Invitrogen	61965-026
Sérum de veau fœtal		GIBCO	10270
La pénicilline-streptomycine		Invitrogen	15140-122
Collagénase de type I		Sigma	C0130-1G
hyaluronidase		Sigma	H4272
Vimentine (V9) antibody		Laboratoires Novocastra	NCL-L- VIM-V9
La ténascine C (BC-8) antibody				un don de Dr Luciano Zardi
α-SMA-Cy3 (1A4) antibody		Sigma	C6198
Prolyl-4-hydroxylase		Dako	M0877
(5B5) antibody
Collagène type1 1A anticorps		Sigma	HPA011795
Pan-cytokératine d'anticorps		Sigma	C5992
D'anticorps fibronectine		BD Biosciences	610077
S100A4/FSP-1 (fibroblastes protein-1 spécifiques) antibody		Dako	A5114
Protéine de surface des fibroblastes (Clone 1B10) antibody		Abcam	ab11333
MSCV-IRES-GFP				Demander aux auteurs de la
pBabe-puro construire				Achat à partir Addgene
Puromycine		Sigma	P8833
DAPI		Sigma	D9564
15 ml tube conique		Corning	430766
Souris nude		Taconic	NCRNU-F	Femme nue RCN
C3H/10T1/2 cellules		ATCC		CCL-226