GENPLAT: une plate-forme automatisée pour Discovery enzymatique de la biomasse et l'optimisation Cocktail

Résumé

GENPLAT (Plateforme Enzyme GLBRC) est une plate-forme automatisée pour la découverte et l'optimisation des cocktails d'enzymes de dégradation de la biomasse. Il peut être adapté à plusieurs matières premières et des mélanges d'enzymes contenant de multiples composants.

Résumé

Le coût élevé des enzymes nécessaires à la déconstruction de la biomasse constitue un obstacle majeur à la conversion économique de matières premières lignocellulosiques en carburants liquides de transport, tels que l'éthanol. Nous avons mis au point une plateforme intégrée à haut débit, appelée GENPLAT, destinée à la découverte et au développement de nouvelles enzymes et de mélanges d'enzymes pour libérer des sucres à partir de diverses combinaisons de prétraitements et de biomasses. GENPLAT comprend quatre éléments : des enzymes pures individuelles, la conception statistique d'expériences, le pipetage robotisé de boues de biomasse et d'enzymes, et la détermination automatisée par colorimétrie du Glc et du Xyl libérés. Les enzymes individuelles sont produites par expression dans Pichia pastoris ou Trichoderma reesei, ou par purification chromatographique à partir de mélanges commerciaux ou d'extraits de micro-organismes nouveaux. Des modèles de mélanges en treillis simplex (factoriels fractionnaires) sont conçus à l'aide d'un logiciel statistique commercial de plan d'expériences. Les mélanges d'enzymes de grande complexité sont préparés par pipetage robotisé dans un format 96 puits. La quantification du Glc et du Xyl libérés est automatisée à l'aide de dosages colorimétriques couplés à des enzymes. Des mélanges d'enzymes optimisés, contenant jusqu'à 16 composants, ont été testés sur diverses combinaisons de matières premières et de prétraitements.

GENPLAT est adaptable à des mélanges d'enzymes pures, des mélanges de produits commerciaux (par exemple Accellerase 1000 et Novozyme 188), des extraits de micro-organismes nouveaux ou à des combinaisons de ceux-ci. Pour préparer et tester des mélanges de ˜10 enzymes purs nécessitent moins de 100 μg de chaque protéine et moins de 100 réactions au total, lorsqu'elles sont utilisées à une charge totale finale de 15 mg de protéine par g de glucane. Nous utilisons des enzymes provenant de plusieurs sources. Les enzymes peuvent être purifiées à partir de sources naturelles telles que des cultures fongiques (par exemple, Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, et Galerina marginata), ou elles peuvent être produites par l'expression des gènes codants (obtenus à partir du nombre croissant de séquences génomiques microbiennes) dans des hôtes tels que E. coli, Pichia pastoris, ou un champignon filamenteux tel que T. reeseiLes protéines peuvent également être purifiées à partir de cocktails enzymatiques commerciaux (par exemple, Multifect Xylanase, Novozyme 188). Un nombre croissant d'enzymes pures, notamment des glycosylhydrolases, des estérases actives sur la paroi cellulaire, des protéases et des lyases, sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux, par exemple Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) et PROZOMIX (www.prozomix.com).

Le logiciel Design-Expert (Stat-Ease, Inc.) est utilisé pour créer des plans simples latice et analyser les réponses (dans ce cas, la libération de Glc et de Xyl). Les mélanges contiennent de 4 à 20 composants, dont les proportions peuvent varier entre 0 et 100 %. Les points d'essai incluent généralement les sommets extrêmes, accompagnés d'un nombre suffisant de points intermédiaires afin de générer un modèle valide. En termes de plan d'expériences, la plupart de nos études relèvent d'expériences « de mélange », ce qui signifie que la somme de tous les composants correspond à une charge totale fixe de protéines (exprimée en mg/g de glucane). Le nombre de mélanges dans le simplexe latice dépend à la fois du nombre de composants du mélange et du degré du polynôme (quadratique ou cubique). Par exemple, une expérience à 6 composants nécessite 63 réactions distinctes avec un modèle cubique spécial augmenté, capable de détecter des interactions à trois facteurs, tandis que seulement 23 réactions individuelles sont nécessaires avec un modèle quadratique augmenté. Pour les mélanges comportant plus de huit composants, un plan d'expérience quadratique est plus pratique, et selon notre expérience, de tels modèles sont généralement valides sur le plan statistique.

Toutes les charges enzymatiques sont exprimées en pourcentage de la charge totale finale (qui, dans nos expériences, est généralement de 15 mg de protéine par g de glucane). Pour les enzymes « centrales », la limite inférieure est fixée à 5 %. Cette limite découle de notre expérience, au cours de laquelle les rendements en Glc et/ou en Xyl étaient très faibles lorsque l'une des enzymes centrales était absente (0 %). Des modèles peu fiables résultent d'un trop grand nombre d'échantillons présentant des rendements très faibles en Glc ou en Xyl. La fixation d'une limite inférieure détermine par conséquent une limite supérieure. Ainsi, dans une expérience à six composants, si la limite inférieure pour chaque composant individuel est fixée à 5 %, la limite supérieure pour chaque composant individuel sera de 75 %. Les limites inférieures pour toutes les autres enzymes considérées comme « accessoires » sont fixées à 0 %. Les désignations « centrale » et « accessoire » sont quelque peu arbitraires et varient selon le substrat, mais dans nos études, les enzymes centrales impliquées dans le relargage du Glc à partir de paille de maïs comprennent les enzymes suivantes provenant de T. reesei : CBH1 (également connue sous le nom de Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1 (Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10) et BX (β-xylosidase).

Protocole

1. La production d'enzymes

1. Produire des protéines dans Pichia pastoris par clonage des gènes correspondants dans des vecteurs ou des pPICZ pPICZα et sa transformation en P. pastoris. Cultiver des cellules dans 300 ml de lots dérouté flacons de 500 ml de méthanol à l'induction de tous les h 24 (Banerjee et al., 2010a).
2. Concentré et dessaler les filtrats de culture par filtration à flux tangentiel.
3. Stocker les enzymes dans de petites aliquotes de 20% de glycérol à -80 ° C. La gamme de concentration est 1-10 mg / ml.

2. Conception de l'expérience

1. Entrez le nombre d'enzymes pour être testés, leurs supérieurs et inférieurs des proportions (par exemple, une proportion plus faible de 5% pour les enzymes de base), et le type de conception expérimentale (par exemple, quadratique ou cubique) dans la conception-Expertsoftware.
2. Calculez le montant en ug de chaque enzyme à ajouter pour faire un chargement total de 15 mg / g de glucane, puis calculer le montant de chaque enzyme en ul à ajouter àchaque réaction.
3. Générer feuilles de calcul Excel en spécifiant matériel de laboratoire de source, puits de source, du matériel de laboratoire de destination, des puits de destination, et les volumes de transfert pour distribution d'eau et d'enzymes selon la conception expérimentale et l'importer dans le logiciel Biomek FXP utilisant la fonction de transfert-de-fichier.

3. L'hydrolyse enzymatique

1. Suspendre la boue de la biomasse dans 50 mM citrate de sodium, pH 4,8, contenant 5 ug / ml de tetracycline et 5 ug / ml de cycloheximide, dans le réservoir à aubes.
2. Robotisé de pipette 200 pl de la suspension dans chaque puits d'une plaque 96 puits de réaction en utilisant des puits profonds Span-8 embouts de pipettes 1000-ul avec la dernière 0.5 cm coupés. Mélangez le coulis une fois à 100 l / sec puis aspirer le même volume du réservoir de paddle et répartir dans les assiettes.
3. Distribuer les enzymes dans la même assiette en utilisant le programme est entré dans le FX Beckman.
4. Sceau des plaques avec capmats perçable.
5. Inversez et frappezles plaques à plusieurs reprises pour surmonter la tension de surface. Placez les plaques à 50 ° C pendant 48 h dans l'hybridation incubateur tournant à 10 rpm.

4. Détermination de Glc et Xyl

1. Centrifuger les plaques de réaction pendant 3 min à 1250 xg dans une centrifugeuse à godets oscillants.
2. Transférer 100 ul du surnageant dans réguliers plaques à 96 puits en utilisant la gousse AP96 du FX Biomek.
3. Incuber les plaques à 90-95 ° C pendant 10 min afin d'inactiver les enzymes, puis centrifuger à 1250 xg pendant 30 sec.
4. Pour des mesures de Glc, transférer 12 ul des surnageants en emploi régulier plaques à 96 puits. Ajouter 192 ul de la glucose oxydase / peroxydase (goPod) réactif. Incuber les plaques à 50 ° C pendant 20 min et lire les absorbances à 510 nm dans un lecteur de microplaques. Blank est mélange réactionnel sans enzyme.
5. Pour des mesures Xyl, transfert 4 pl dans 384 puits. Ajouter les réactifs de dosage et de lire les plaques à 340 nm. Viergeest le mélange réactionnel sans enzyme.

5. Analyse des données

1. Convertir les valeurs d'absorbance à leur Glc% et des rendements sur la base des Xyl connue Glc et le contenu Xyl de la biomasse d'origine. Importer ces pourcentages que les réponses dans le logiciel Design-Expert. Vérifiez la paramenters statistiques pour être sûr que les critères d'un modèle robuste sont remplies.
2. Confirmer la meilleure prédiction du modèle expérimental.

6. Les résultats représentatifs avec GENPLAT:

(1) Création de mélanges optimisés des individuels protéines pures. Les résultats indiquent que les enzymes sont importants, et dans quelles proportions, et aussi quelles enzymes ne sont pas importants. Certaines protéines qui sont abondantes dans le T. reesei sécrétome (Nagendran et al., 2009), comme Cip1 et CIP2, semblent jouer aucun rôle dans la libération Glc à partir de maïs prétraités par l'expansion de fibres d'ammoniaque (AFEX) ou alcalines hyd Stover peroxyde d'Rogen (AHP) (Banerjee et al., 2010b). D'autre part, certaines protéines sont importantes inattendue. Par exemple, l'endo-xylanases de familles Hydrolase glycosyle 10 et 11 sont toutes deux importantes pour Glc libération; une xylanase peut pas se substituer à l'autre (Banerjee et al, 2010b, c).. Cel61A, une protéine mineure dans le T. reesei sécrétome, est très important pour Glc mais pas Xyl communiqué. Certaines enzymes sont importantes pour la libération des deux Glc et Xyl, alors que d'autres ne sont nécessaires que pour l'une ou l'autre (Banerjee et al., 2010c).

Un mélange synthétique contenant 16 éléments, chacun à une concentration de 0,94 mg / ml (c'est à dire, un mélange non optimisé), a publié 38% de la disposition du Glc AFEX-prétraités DDG. Dans des conditions identiques hydrolyse, un mélange optimisé, dans laquelle les concentrations des 16 composantes variait de 0% à 32%, a publié 52% de la CGL (Fig. 2). Cette expérience illustre l'utilité de construire des mélanges définis.

_content "> (2) Création de cocktails optimisé pour un prétraitement différent / combinaisons substrat. actuelle des préparations commerciales sont cellulase" one-size-fits-all ". En réalité, le meilleur cocktail dépend à la fois le substrat et le prétraitement. Un seul produit tels que Accellerase 1000 donne des rendements différents de différents substrats prétraités de la même manière, et à partir du même substrat exposée à différents prétraitements (Fig. 1). Nous avons utilisé pour optimiser les mélanges GENPLAT des enzymes pures de prétraitement des matières premières et de multiples mutiple (Banerjee et al., 2010c). figure 2 montre comment les proportions optimales d'enzymes de 16 enzymes pures diffère du maïs AFEX-prétraités canne, le maïs PLA-prétraités Stover et AFEX-prétraités DDG. Seulement 11 enzymes sont présentés dans la figure 2. optimale parce que la proportions des cinq autres (Cel61B, AbfB, Cip1, point d'appel 2, et Cel12A) ont été trouvés à 0% (Banerjee et al., 2010c).

(3) découverte de nouvelle enzyme T. reesei et A. Niger cultivés sur différents substrats. Un extrait particulièrement stimulé le rendement Glc lorsqu'il est ajouté à notre noyau. La protéine responsable a été purifié et montré être un roman de glycosyl hydrolase pas présent dans toute préparation enzymatique commerciale (Banerjee et Walton, résultats non publiés).

(4) Découverte de la meilleure des enzymes. Ayant montré avec GENPLAT laquelle les enzymes sont les plus importants de la dégradation d'unparticulier la biomasse, nous avons une meilleure compréhension de laquelle les enzymes devrait être le centre d'amélioration. Mieux exemples des enzymes essentielles pourraient être trouvés par la recherche dans la nature ou fabriqués par l'ingénierie des protéines. (Une enzyme pourrait être «mieux» que son homologue de T. reesei de plusieurs façons, selon la propriété désirée, par exemple, l'activité spécifique plus élevée, une plus grande synergie, une diminution de la sensibilité protéolytique, ou une meilleure stabilité thermique). GENPLAT fournit une plate-forme significative pour doser les enzymes potentiellement mieux, car il utilise un cocktail réaliste complexes (important car aucune enzyme biomasse fonctionne en vase clos) et un substrat réaliste (important car les résultats avec de la cellulose pure ou d'autres substrats artificiels peuvent ne pas être pertinents pour lignocellulosiques naturelles matériaux).

(5) l'optimisation de l'enzyme de commerce. Quantité suffisamment importante d'enzymes pures n'existent pas encore dans le monde réel. Jusqu'à ce qu'ils font, l'éthanol Proproducteurs doivent compter sur des produits commerciaux tels que Accellerase 1000 et MultifectXylanase. Toutefois, les mélanges d'enzymes commerciaux fonctionnent généralement mieux que tout autre individu, et GENPLAT peut être utilisé pour la conception optimisée de multiples cocktails enzymes commerciales. La figure 3 montre l'utilisation de GENPLAT pour optimiser un mélange de quatre préparations enzymatiques commerciales. Les proportions optimales pour la libération de Glc d'AFEX-prétraités DDG ont été trouvés à 47% Accellerase1000, 27% Multifect pectinase, 22% Novozyme 188, et 4% Multifect xylanase (Banerjee et al., 2010c). La figure 3B montre les différences dans le rendement du Glc AFEX-DDG avec quatre préparations enzymatiques; le mélange optimisé commerciale donne un rendement plus élevé que Glc Accellerase1000 seul, SpezymeCP seul, ou un mélange de 16 composants synthétiques. Cette expérience indique également que le mélange de 16 composant synthétique qui manque un ou plusieurs enzymes nécessaires à la libération optimale Glc, qui sont présents dans un ou plusieurs des enzymes commerciales. GENPLAT peut nous êtreED afin d'identifier de tels composants.

Figure 1. Pas de préparation enzymatique commerciale unique est optimale pour tous les supports et tous les prétraitements. Cinq substrats et trois prétraitements ont été comparés dans des conditions similaires de broyage (0,5 mm la taille des particules), le chargement d'enzymes (15 mg / g de glucane), et les conditions de l'hydrolyse (48 h, 50 ° C). A. La digestion des différents substrats prétraités AFEX- avec Accellerase 1000. Digestion B. canne de maïs prétraités par trois méthodes différentes avec Accellerase 1000 (voir Banerjee et al., 2010c).

Figure 2. Proportions optimales de 11 enzymes pour la libération de Glc d'AFEX-canne de maïs prétraités (AFEX-CS), alcalines d'hydrogène peroxyde de maïs prétraités Stover (PLA-CS), ou AFEX-prétraitées séchées distillentvailleurs céréales (AFEX-DDG). Les données proviennent de Banerjee et al. (2010c). Numéros en haut des barres sont les rendements Glc que un pour cent du total Glc dans l'échantillon de la biomasse.

Figure 3. A. L'utilisation de GENPLAT pour produire un mélange optimisé de quatre préparations enzymatiques commerciales pour la libération de Glc d'AFEX-prétraités DDG. Multifect xylanase fait la plus petite contribution (4%) et a donc été omis dans ce diagramme ternaire. B. rendements Glc d'AFEX-DDG avec des traitements enzymatiques différentes, dans des conditions identiques hydrolyse (15 enzymes glucane mg / g, 48 h, 50 ° C) . "Quatre-composante commerciale" a les proportions déterminées par l'expérience le montre la figure. 3A.

Discussion

Il est largement reconnu que la réduction du coût des enzymes est important pour le développement d'une industrie d'éthanol lignocellulosique économique. Actuellement disponibles cocktails enzymatiques commerciales sont des mélanges complexes et mal définies de nombreuses protéines (Nagendran et al., 2009), et ils sont adaptés pour une utilisation essentiellement sur l'acide prétraité les tiges de maïs. Afin d'accélérer le développement de cocktails enzymatiques mieux, plusieurs laboratoires ont développé des plates-formes à haut débit pour la découverte et la caractérisation d'enzymes. Les efforts dans ce domaine ont intégré un ou plusieurs des propriétés suivantes ont également trouvé dans GENPLAT: robotique de distribution d'enzymes et de boues de la biomasse, la conception statistique de l'expérience et / ou la détermination automatisée de Glc et Xyl (Berlin et al, 2007; Decker et al. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT étend ces efforts antérieurs, la plupart de manière significative dans la complexité des mélanges d'enzymes qui peuvent être analysés à partir au plus 6 composantsles études antérieures à plus de 16 dans notre dernier travail (Banerjee et al., 2010c). D'autres caractéristiques clés de GENPLAT sont l'utilisation d'une chambre de mélange billes (réservoir aube) qui peuvent garder boues tiges suspendues pendant la distribution; mélange en douceur lors de la digestion d'ici la fin de plus en bout de rotation, et automatisé dosage colorimétrique du Glu et Xyl.

Matériaux

Equipements et logiciels utilisés:

1. Design-Expert logiciel, la version 8.0 (Stat-Ease, Inc, Minneapolis, MN) ( http://www.statease.com )
2. Biomek FXP automatisation des laboratoires poste de travail (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP logiciel, la version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Réservoir de Paddle (modèle VP-756C 1P100, V & P Scientific Inc, San Diego)
5. Plaques, 96 de profondeur (1,5 ml) et (ABgene, Fisher Scientific, Epson, Royaume-Uni)
6. Capmats perçable (Etats-Unis scientifique, Ocala, Floride)
7. L'hybridation rotatif incubateur (Modèle 5420, VWR)
8. Swinging-seau de centrifugeuse (Modèle 5810R, Eppendorf, Hambourg, Allemagne)
9. Assiettes, Costar de 96 puits (ABgene, Fisher Scientific, Epson, Royaume-Uni)
10. Assiettes, de 384 puits (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Réactifs utilisés:

1. Pichia pastoris et les vecteurs: la souche X33, et pPICZ et pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei et les vecteurs: la souche QM9414 (Département américain de l'Agriculture Centre national de recherche sur l'utilisation agricole, Peoria, IL), et pCB1004-EV (Banerjee et al, 2010b).
3. Accellerase 1000 (1600844643 numéro de lot) (Genencor, Inc, Rochester, NY)
4. 50 mM de tampon citrate de sodium, pH 4,8
5. Tétracycline stock: 10 mg / ml
6. Stock de cycloheximide: 10 mg / ml
7. GoPod test kit, catalogue K-gluc (Megazyme, Bray, Irlande)
8. Xylose test kit, le catalogue de K-xylose (Megazyme, Bray, Irlande)