Ici, nous proposons des méthodes simples pour tester et évaluer la présence d'espèces réactives de l'oxygène dans les cellules.
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Article de méthode
Production et détection d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cancers
Dans cet article
Résumé
Résumé
Espèces réactives de l'oxygène comprennent un certain nombre de molécules qui endommagent l'ADN et d'ARN et d'oxyder les protéines et les lipides (peroxydation lipidique). Ces molécules réactives contiennent un atome d'oxygène et comprennent H 2 O 2 (peroxyde d'hydrogène), NO (oxyde nitrique), O 2 - (anion oxyde), le peroxynitrite (ONOO -), l'acide hydrochlorous (HOCl), et le radical hydroxyle (OH -) .
Espèces oxydantes sont produites non seulement dans des situations pathologiques (cancers, la reperfusion ischémique /, les pathologies neurologiques et cardiovasculaires, les maladies infectieuses, maladies inflammatoires 1, 2 maladies auto-immunes, etc ...) mais également lors de situations physiologiques (non pathologiques), tels que le métabolisme cellulaire 3 , 4. En effet, les ROS jouent un rôle important dans de nombreuses voies de signalisation cellulaire (prolifération, l'activation des cellules 5, 6, 7 migrations etc.). ROS peut être nuisible (elle est alors appelée"Stress oxydatif et nitrosatif»), lorsqu'elle est produite en grande quantité dans les compartiments intracellulaires et les cellules répondent généralement à des ROS par upregulating antioxydants tels que la superoxyde dismutase (SOD) et catalase (CAT), glutathion peroxydase (GPx) et glutathion (GSH) qui protège entre eux en convertissant les dangereux radicaux libres des molécules inoffensives (l'eau). Les vitamines C et E ont également été décrits comme des charognards ROS (antioxydants).
Les radicaux libres sont bénéfiques en faible quantité 3. Macrophages et des neutrophiles réponses immunitaires à médiation impliquent la production et la libération de NO, ce qui inhibe les virus, les pathogènes et la prolifération tumorale 8. NO réagit également avec d'autres ROS et donc, a aussi un rôle comme un détoxifiant (scavenger ROS). Enfin NO agit sur les navires de réguler le flux sanguin qui est important pour l'adaptation du muscle à l'exercice prolongé 9, 10. Plusieurs publications ont également démontré que les ROS sont impliqués dans des Sénateurs d'insulineitivity 11, 12.
De nombreuses méthodes pour évaluer la production de ROS sont disponibles. Dans cet article, nous proposons plusieurs tests simples, rapides et abordables; ces tests ont été validés par de nombreuses publications et sont couramment utilisées pour détecter les ROS ou de ses effets dans les cellules de mammifères. Si certains de ces dosages permettent de déceler plusieurs ROS, d'autres ne détecter que d'un seul ROS.
Protocole
1. La détection des ROS en utilisant carboxy-H 2 DCFDA
Carboxy-H 2 DCFDA est non fluorescent, mais en présence des ROS, quand ce réactif est oxydé, il devient vert fluorescent.
- Immédiatement avant utilisation, préparer une solution de base fraîches de carboxy-H 2 DCFDA dans le diméthylsulfoxyde stérile (DMSO) ou de l'éthanol à 100%. Évitez de multiples dégel / gel des cycles de votre teinture.
- Laver les cellules avec HEPES solution saline tamponnée (HBSS) ou un tampon phosphate salin (PBS) pour enlever les traces du support original.
- Chargez les cellules avec le colorant (et ....
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Discussion
Plusieurs situations pathologiques telles que les maladies inflammatoires, les cancers, l'ischémie / reperfusion, et aussi des traitements tels que radiothérapie ou la chimiothérapie (cisplatine par exemple) induisent une surproduction de ROS. Ainsi, en détectant et en mesurant les niveaux de ROS est important dans de nombreux fondamentale, les études pré-cliniques et cliniques. Toutefois, les ROS sont des demi-vies très courtes et pourrait être compliqué à détecter. Ici, nous proposons des tests simples qui sont ut.......
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Déclarations de divulgation
Nous avons reçu le soutien de Promega pour cette publication.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de Santé (CA142664).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| 5 - (et 6)-carboxy-2 ', 7'-dichlorofluorescéine diacétate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes | C369 | de contrôle |
| carboxy-H 2 DCFDA | Molecular Probes | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dichlorhydrate | Sigma | N9125-10G | |
| Standard de nitrite | Sigma | 237213-100G | |
| GSH / GSSG-Glo Assay | Promega | V6612 | Pour quantifier oxydé, réduit ou oxydé / glutathion réduit |
Références
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythem....
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Réimpressions et autorisations
