Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정
Summary
Bicelles은 지질 이중층 내에서 막 단백질 (MPS)를 유지하지만, 결정화 로봇에 의해 높은 처리량 검사를 용이하게 독특한 위상 동작을 가지고 지질 / amphiphile 혼합물입니다. 이 기술이 성공적으로 prokaryotic과 진핵 소스 모두에서 고해상도 구조의 수를 생산하고 있습니다. 이 비디오는 매체에서 crystallizations 재판 (수동뿐만 robotically) 및 수확 결정을 설정, bicelle 혼합물로 의원을 포함, lipidic bicelle 혼합물을 생성하기위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
막 단백질 (MPS)는 이러한 모든 세포 organelles 주변 달리 스며들지 막 이중층에 걸쳐 특정 분자를 펌프 등 많은 생리 과정에 중요한 역할을한다. 많은 인간의 질병 및 장애의 의원 결과의 함수에서 변경, 따라서 그들의 구조 복잡한 이해 생물 학적 연구를위한 중요한 목표 남아있다. 그러나, 의원의 구조 결정은 종종 자신의 소수성에서 형태소 분석 중대한 도전 남아있다.
의원은 이중층 내에 포함된 실질적인 소수성 영역을했습니다. 세제는 자주 다음 수용성 단백질과 비슷한 방식으로 조작할 수있는 단백질 세제 마이셀을 생성 이중층에서 이러한 단백질을 solubilize하는 데 사용됩니다. 전통적으로, 결정화 실험은 단백질 세제 혼합물을 사용하여 진행,하지만 그들은 종종 결정에 저항하거나 품질의 크리스털을 생산하고 있습니다. 이러한 문제로 인해 발생하는세제의 무능력이 적절하게 가난한 안정성과 이질에 발생하는 이중층을 모방합니다. 또한, 세제의 보호막은 MP의 소수성 표면은 크리스탈 연락처에 사용할 수있는 면적을 줄일 수. 회피 이러한 단점의 의원이 더 밀접하게 자신의 내생적인 환경을 시뮬레이트 lipidic 미디어에서 크리스털 수 있으며, 최근에는 MP의 결정화에 대한 드 노보 기술되고있다.
Lipidic 입방 위상 (LCP)는 수성 채널 1의 상호 침투 시스템에 의해 3 차원 지질 이중층입니다. monoolein 선택의 지질이지만, 그러한 monopalmitolein 및 monovaccenin 같은 관련 lipids는 또한 LCP 2를 만들기 위해 사용되었습니다. 의원들은 세 차원과 공급 결정 핵의 확산 LCP에 포함됩니다. LCP의 큰 장점은 단백질이 더 네이티브 환경에 남아있다,하지만 방법은 높은 visc 포함한 기술적 단점을 가지고 있습니다osity (전문 apparatuses을 필요로하는)와 크리스탈 시각화 및 조작 3,4의 어려움. 때문에 이러한 기술적인 문제, 우리는 결정 – bicelles 5,6 (그림 1)에 대해 다른 lipidic 매체를 활용. Bicelles는 amphiphile (CHAPSO) 또는 짧은 사슬 지질 (DHPC)와 phosphatidylcholine의 지질 (DMPC)를 혼합하여 형성 지질 / amphiphile 혼합물입니다. amphiphile 분자 선 apolar 가장자리 bilayers와 세제 모두 유익한 속성을 제공함과 동시에 각 bicelle 디스크 내에 지질 분자는 이중층를 생성합니다. 중요한 것은, 그들의 전이 온도 아래 단백질 bicelle의 혼합물은 감소 점도를 가지고 결정화 로봇과 bicelles 호환 만들기, 세제 – solubilized 의원과 비슷한 방식으로 조작됩니다.
Bicelles가 성공적으로 여러 멤브레인 단백질에게 5,7-11 (표 1) 구체화하는 데 사용되었습니다. 이 성장 컬렉션단백질의 prokaryotic과 진핵 소스에서 알파 헬리컬 및 베타 시트 의원 모두 crystallizing에 대한 bicelles의 다재 다능한이 보여줍니다. 때문에 이러한 성공과 높은 처리량 구현의 단순의 bicelles 모든 멤브레인 단백질 crystallographer의 아스날의 일부가되어야합니다. 이 비디오에서는, 우리는 bicelle 방법을 설명하고 표준 로봇을 사용하여 의원을 정화의 높은 처리량 결정화 실험을 설정하는 데 필요한 단계별 절차를 제공합니다.
Protocol
Discussion
Bicelles는 세제로 solubilized 것처럼 행동하면서 기본 이중층 같은 환경을 제공하는 독특한 lipidic 미디어입니다. 어떤 학습 곡선 또는이 기법에 필요한 전문 장비가 없기 때문에이 속성은 bicelles에게 다른 지질 기반 결정화 방법에 비해 뚜렷한 장점을 제공합니다. 일단 bicelles가 상업적 또는 실험실에서 준비 중 사용할 수있는, 그들은 결정화 실험은 거의 정확하게 표준 세제 기반 프로토콜과 수행에 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Drs를 감사하고 싶습니다. bicelle 방법과 유용한 토론 박사 Aviv 파스에 대한 기술 전문 지식과지도를 제공하는 제임스 보위와 살렘 Faham. 우리는 실험 지원 르 뒤를 인정합니다. Rachna Ujwal 그러나이 작품을 지원하지 않았 MemX Biosciences LLC에서 금융 관심이 있습니다. 이 작품은 NIH (RO1 GM078844)에서 부여에 의해 일부 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
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