Isoler LacZ cellules exprimant des tissus de la souris oreille interne par cytométrie en flux

Résumé

La cytométrie en flux est un outil puissant permettant l’isolement et l’étude de populations cellulaires spécifiques. Ce protocole décrit les étapes d’isolement des cellules exprimant LacZ dans les tissus cochléaires de souris transgéniques néonatales. Les cellules cochléaires dissociées ont été marquées à l’aide de substrats conjugués fluorescents de β-galactosidase avant la séparation par cytométrie en flux.

Résumé

L’isolement de types cellulaires spécifiques permet d’analyser des populations cellulaires rares telles que les cellules souches/progénitrices. Une telle approche pour étudier les tissus de l’oreille interne présente un défi unique en raison de la rareté des cellules d’intérêt et du peu de modèles de souris rapporteures transgéniques. Ici, nous décrivons un protocole utilisant des sondes conjuguées à la fluorescence pour marquer sélectivement les cellules LacZ positives des cochlées néonatales.

La pathologie sous-jacente la plus courante de la perte auditive neurosensorielle est l’endommagement irréversible et la perte de cellules ciliées sensorielles cochléaires, qui sont nécessaires pour transduire les ondes sonores en impulsions neurales. Des preuves récentes suggèrent que les organes auditifs et vestibulaires murins hébergent des cellules souches/progénitrices qui peuvent avoir un potentiel de régénération^1,2. Ces résultats justifient une étude plus approfondie, y compris l’identification de types de cellules spécifiques présentant des caractéristiques de cellules souches/progénitrices. Il a été démontré que la voie de signalisation Wnt joue un rôle essentiel dans le maintien des populations de cellules souches/progénitrices dans plusieurs systèmes d’organes^3-7. Nous avons récemment identifié des cellules exprimant Axin2 sensibles à Wnt dans la cochlée néonatale, mais leur fonction est largement inconnue⁸.

Pour mieux comprendre le comportement de ces cellules sensibles à Wnt in vitro, nous avons développé une méthode pour isoler les cellules exprimant Axin2 à partir de cochlées de souris rapporteures Axin2-LacZ⁹. En utilisant la cytométrie en flux pour isoler les cellules positives Axin2-LacZ des cochlées néonatales, nous avons pu à notre tour réaliser diverses expériences sur des cellules vivantes pour interroger leur comportement en tant que cellules souches/progénitrices. Nous décrivons ici en détail les étapes de la microdissection de la cochlée néonatale, de la dissociation de ces tissus, du marquage des cellules LacZ-positives à l’aide d’un substrat fluorogénique et du tri cellulaire. Des techniques de dissociation des cochlées en cellules uniques et d’isolement des cellules cochléaires par cytométrie en flux ont été décrites^2,10-12. Nous avons apporté des modifications à ces techniques afin d’établir un nouveau protocole pour isoler les cellules exprimant LacZ de la cochlée néonatale.

Protocole

1. Microdissection de la cochlée

1. Préparez le microscope de dissection sous le capot en essuyant les surfaces avec de l’éthanol à 70 % et en plaçant des blocs de glace.
2. Préparez 10 à 15 boîtes de Pétri de 35 mm dans des conditions stériles et remplissez-les à moitié (~2 ml) avec une solution saline équilibrée de Hank avec calcium (HBSS) stérile.
3. Préparez deux boîtes de Pétri de 35 mm dans des conditions stériles et remplissez-les à moitié (~2 ml) avec une solution tamponnée stérile 1x phosphate (PBS).
4. Stérilisez les micro-pinces dans un tube conique Falcon de 50 ml avec 70 % d’éthanol.
5. Dans une pièce séparée de la hotte stérile, utilisez des ciseaux à iris pour décapiter 12 à 15 souris rapporteures Axin2^LacZ/+ postnatales (P) âgées de 0 à 3 jours et placez les têtes sur une boîte de Pétri de 60 mm sur un bloc de glace.
6. À l’aide d’une pince Dumont #5 et de ciseaux à iris, excisez la mandibule et la langue et coupez la base du crâne au niveau du palais.
7. Retirez la peau sus-jacente de la calvaria et transectez la base du crâne en insérant les ciseaux dans la partie inférieure du foramen magnum jusqu’au milieu du palais.
8. Faites une autre incision avec des ciseaux à iris du bord coupé du palais à l’aspect supérieur de la calvaria des deux côtés, en faisant attention de ne pas endommager la capsule otique.
9. Isolement complet de l’os temporal en faisant deux incisions inclinées à 45 degrés à partir de la face supérieure du foramen magnum s’étendant jusqu’à la coupure coronale au palais dur.
10. Placez les os temporaux isolés dans des boîtes de Pétri de 35 mm contenant du HBSS sur un bloc de glace.
11. Collectez des os temporaux d’environ 12 à 15 animaux qui ont été sacrifiés, pour un total de 24 à 30 os temporaux.
12. Transférer la boîte de Pétri avec les os temporaux isolés dans une hotte de dissection stérile préalablement préparée (1.1).
13. Transférez quatre os temporaux dans chaque boîte de Pétri de 35 mm pré-préparée contenant HBSS (1.2) et placez-les sur un bloc de glace.
14. Commencez la microdissection à l’aide de deux pinces #55 pour retirer doucement le cortex, le tronc cérébral et le cervelet dans l’os temporal recouvrant la capsule otique.
15. Sans retirer la capsule otique, écaillez les parties de la capsule cochléaire en commençant à l’entrée du nerf vestibulocochléaire dans la capsule otique.
16. Après l’exposition de la base de la cochlée, retirez doucement la cochlée et les tissus environnants. Retirez tout ganglion spiralé restant et la strie vasculaire en commençant à la base.
17. Transférer la cochlée dans une boîte de Pétri de 35 mm contenant du PBS sur un bloc de glace.
18. Pour une viabilité tissulaire optimale, la durée totale de la dissection doit être inférieure à 60 min.
19. Répétez les étapes ci-dessus pour 3 à 5 souris P0-P3 de type sauvage (WT) comme témoins pour les souris Axin2-LacZ.

2. Dissociation cellulaire (modifiée par rapport aux méthodes décrites précédemment)^2,10

1. Placez 50 μl de PBS stérile au centre d’un puits dans une boîte de culture non enrobée à 6 puits.
2. Transférez jusqu’à 20 cochlées Axin2^LacZ/+ dans chaque gouttelette de 50 μl de PBS. Une nouvelle gouttelette de 50 μl de PBS doit être utilisée pour plus de 20 cochlées.
3. Préchauffer 50 μl d’aliquotes de trypsine à 0,125 % pendant ~2 minutes dans un bain-marie à 37 °C.
4. Ajoutez 50 μl de trypsine préchauffée à 0,125 % au PBS contenant les cochlées.
5. Placez le plat 6 puits à 37°C pendant 8 min, en prenant soin de ne pas secouer le plat.
6. Pour mettre fin à la trypsinisation, ajoutez 50 μl d’inhibiteur de trypsine de soja à chaque gouttelette de 100 μl.
7. Ajouter 50 μl supplémentaires de Full Media (FM) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, ampicilline dans DMEM/F12)²
8. À l’aide d’une pointe de pipette émoussée de 300 μl et d’une pipette p200 réglée à 125 μl, triturez doucement les cellules 80 fois, en prenant soin de ne pas créer de bulles.
9. Après la trituration de chaque gouttelette, ajoutez 200 μl supplémentaires de FM dans chaque puits.
10. Faites passer les cellules à travers une crépine à cellules Falcon bleue de 40 μm dans un nouveau puits.
11. Transférez les cellules sur des tubes Falcon FACS standard (il reste environ 300 μl après trituration et filtration).
    1. Divisez les cellules de cochlées de type sauvage en trois tubes, en diluant 100 μl avec 300 μl de FM dans chaque tube. Un tube sera utilisé comme témoin à blanc, l’autre sera coloré à l’iodure de propidium (PI, 1 μg/ml) uniquement (à ne pas ajouter à cette étape), tandis que le dernier sera coloré au 3-carboxyumbelliferyl β-D-galactopyranoside (CUG, voir 2.15) pour détecter la fluorescence de fond.
    2. Placez 400 μl de cellules dissociées des cochlées Axin2-LacZ dans chaque tube FACS. En tant que témoin CUG uniquement, diluez 10 μl de cellules dans 390 μl de FM (voir tube F à l’étape 2.15). Porter le volume des tubes restants à 400 μl.
12. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C pendant 10 min.
13. Préparez la solution CUG :
    1. Préparez 200 μl de CUG pour chaque tube FACS nécessitant une coloration.
    2. Diluer CUG en FM 1:50 dans un pare-soleil sombre avec une exposition minimale à la lumière.
    3. Préchauffer le CUG dilué à 37 °C pendant 3 à 5 minutes.
14. Ensuite, ajoutez 200 μl de CUG dilué dans chaque tube FACS approprié. Pour les tubes qui ne sont pas désignés pour avoir CUG, ajouter FM uniquement (voir 2.15).
15. À ce stade, il devrait y avoir cinq catégories de tubes avec le contenu suivant (n’ajoutez pas d’IP à cette étape) :
    1. Wildtype - sans CUG ni PI (pour la compensation, voir étape 3.5-6)
    2. Wildtype - avec PI uniquement (contre rémunération)
    3. Wildtype - avec CUG et PI (pour le contrôle contre les cellules Axin2-LacZ)
    4. Axin2-LacZ - avec CUG uniquement (contre rémunération)
    5. Axin2-LacZ - avec CUG et PI (pour le tri réel des cellules)
    6. Axin2-LacZ - avec CUG et PI (pour l’analyse d’événements)
16. Protégez tous les tubes de la lumière et incubez-les dans un incubateur humidifié à 37°C pendant 25 minutes.
17. Préparez une solution fraîche d’HEPES + sérum de veau fœtal (FBS) pour arrêter la réaction après l’incubation :
    1. Diluer 400 μl de FBS fraîchement décongelé dans 10 ml de HEPES stérile 10 mM (en PBS) dans un tube Falcon de 15 ml.
    2. Placez le tube sur de la glace jusqu’à la fin de 2.16.
18. Ajouter 1,8 ml de solution glacée d’HEPES dans chaque tube FACS sous une hotte stérile avec les lumières éteintes pour minimiser l’exposition à la lumière.
19. Centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant 5 minutes.
20. Retirer les cellules surnageantes et les remettre en suspension dans 300 μl FM, regrouper toutes les aliquotes pour l’échantillon de tri (Axin2-LacZ coloré avec CUG et PI).
21. Ajouter de l’IP dans chaque tube pour obtenir une concentration finale de 1 μg/ml.
22. Placez les cellules sur de la glace et protégez-les de la lumière.

3. Cytométrie en flux

1. Nous utilisons un BD Aria II équipé de lasers de 488 nm, 633 nm et 407 nm. La détection du CUG a été effectuée à l’aide du laser violet de 407 nm et l’IP à l’aide du laser bleu de 488 nm à l’installation FACS partagée de Stanford.
2. Un opérateur de cytomètre en flux formé est nécessaire. Passez à l’étape suivante après avoir réchauffé les lasers, étalonné les détecteurs de cytomètres selon les instructions du fabricant et réglé les paramètres de tri optimaux. D’après notre expérience, nous avons constaté que l’utilisation d’une buse de 100 μm optimise la viabilité cellulaire pour les expériences ultérieures.
3. Les paramètres suivants ont été utilisés : seuil à 5 000 événements, débit inférieur à 3 000 événements/seconde, diffusion directe (FSC) à 125 volts et diffusion latérale (SSC) à 250 volts, canal PE-Cy5 utilisé pour PI et Cascade Blue pour CUG.
4. Rincez la chambre du cytomètre avec de l’éthanol à 70 % et du PBS deux fois dans cet ordre.
5. Commencer l’analyse avec des cellules non colorées de type sauvage (tube A à l’étape 2.15). Collectez 1 000 événements pour déterminer la distribution des cellules sur le graphique FSC par rapport au graphique SSC. Si la diffusion n’est pas souhaitée, ajustez les paramètres FSC et SSC.
6. Effectuez une compensation à l’aide de cellules WT non colorées (tube A), WT colorées PI (tube B) et Axin2-LacZ (tube D) colorées CUG. La compensation permettra une discrimination plus précise du signal entre les différentes longueurs d’onde laser.
7. Démarrez l’analyse avec des cellules de type sauvage colorées PI et CUG (tube C) et définissez les paramètres de déclenchement pour :
   1. Exclusion des débris sur la base du tracé FSC par rapport au CSS.
   2. Exclusion des doublets et des touffes à l’aide d’un tracé de hauteur FSC par rapport à une parcelle de surface FSC.
   3. Exclusion des cellules mortes sur la base du tracé de la zone FSC par rapport à la zone PE-Cy5.
   4. Configurez le tracé de la zone FSC par rapport à la zone Cascade Blue avec n’importe quel placement de porte.
8. Ensuite, analysez 10 000 événements à partir d’un tube d’échantillon trié contenant des cellules colorées Axin2-LacZ PI et CUG (tube F).
   1. Toutes les portes définies à l’aide de cellules de type sauvage doivent être appliquées ici.
   2. À l’aide de tracés pour les cellules de type sauvage, créez des portes pour les cellules Cascade Blue-high qui représentent moins de 1 % du nombre total d’événements.
   3. Ces mêmes portes de Cascade Blue-high englobent maintenant environ 15 à 20 % des cellules de l’échantillon Axin2-LacZ, ce qui fait de ces cellules Axin2-high.
   4. À l’aide du graphique d’analyse des cellules Axin2-LacZ, créez une porte pour les 15 à 20 % de cellules les moins fluorogéniques, désormais les cellules Axin2-low.
9. Sur la base de la stratégie de déclenchement susmentionnée, trier les cellules dans des tubes FACS contenant 500 μl de FM, un tube pour les cellules Axin2-high et l’autre pour les cellules Axin2-low. Assurez-vous que les tubes de collecte sont dans une chambre refroidie à 4°C pendant le tri.
10. Enregistrement du nombre de cellules comptées par cytomètre en flux pour chaque population.

4. Résultats représentatifs (voir Figure 2) :

Avec le protocole ci-dessus, nous récupérons généralement 40 à 45 % de cellules exemptes de débris à la fois de la cochlée^LacZ/+ de type sauvage et d’Axin2 (Figures 2A et B), avec environ 70 % d’entre elles exemptes de doublets (voir Figures 2A' et B'). La plupart des cellules triées sont viables et n’ont pas absorbé de PI (~95 %) (Figures 2A'' et B''). En moyenne, les cellules supérieures ~20 % CUG positives sont considérées comme des cellules positives à Axin2-LacZ (Figure 2B''') et sont corrélées à environ 15 000 cellules Axin2-LacZ-high pour 10-12 animaux.

L’analyse de re-tri par cytométrie en flux des cellules à haute teneur en Axin2 a révélé une pureté supérieure à 93 % dans le canal Cascade Blue. Afin de confirmer davantage l’identité de ces cellules, nous avons effectué une immunocoloration post-tri des cellules Axin2-high et Axin2-low à l’aide d’anticorps anti-β-galactosidase, et avons constaté que les cellules Axin2-high contenaient ~93,4 % de cellules β-galactosidase positives (plus de 1 500 cellules analysées) et que les cellules Axin2-low contenaient ~4,8 % de cellules β-galactosidase positives.

Figures et tableaux :

Graphique 1.Paradigme expérimental. La figure ci-dessus illustre la stratégie et les techniques expérimentales globales décrites dans la section sur le protocole. Les cochlées de souris de type sauvage et Axin2^LacZ/+ sont récoltées et dissociées en cellules uniques, qui ont ensuite été traitées avec CUG, un substrat fluorescent pour la β-galactosidase. Les cellules Axin2-LacZ-high et -low ont ensuite été séparées par cytométrie en flux. Cliquez ici pour voir une version en taille réelle de cette image.

Graphique 2.Stratégies de contrôle. Cette figure illustre les stratégies de contrôle de cytométrie en flux utilisées. A) Les cellules de type sauvage dissociées qui ont subi le même traitement que les cellules Axin2-LacZ sont analysées ici à l’aide d’un total de 10 000 événements. Le premier panneau illustre la zone de diffusion latérale (SSC-A) par rapport à la zone de diffusion directe (FSC-A). Ici, un groupe distinct d’événements est d’une taille beaucoup plus grande que les événements plus proches de l’axe des y. Ces événements sont désignés comme les « débris négatifs ». La porte suivante, A', analyse les cellules « Débris négatifs » du panneau A, ce qui représente 43,8 % du nombre total d’événements (voir tableau ci-dessous). Dans ce panneau, la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H) par rapport à la FSC-A est utilisée pour exclure les doublets. Les événements qui s’écartent de la nature linéaire attendue du graphique sont exclus. Cette préparation produit généralement ~70 % d’événements à l’intérieur de la porte désignée, et les cellules restantes sont exclues. Dans le panel A'', l’iodure de propidium (PI), détecté par le canal PE-Cy5, est utilisé pour marquer les cellules mortes (5,3 %). Dans le panneau suivant (A'''), le canal bleu Cascade est utilisé pour détecter le substrat fluorescent CUG. Ici, les portes de LacZ comprennent moins de 1 % du total des événements. B) Les cellules dissociées de souris Axin2-LacZ traitées avec CUG et PI sont analysées ici à l’aide d’un total de 10 000 événements. Des portes identiques du panneau A sont appliquées ici. B' montre que 29,5 % des cellules sont exclues en tant que doublets tandis que B'' démontre que 5,4 % ne sont pas viables. Les portes initiales pour les cellules LacZ-high et -low sont dessinées à l’aide du panneau B''', LacZ-high étant initialement fixé à 19,7 % et LacZ-low à 20,4 %. Cliquez ici pour voir une version en taille réelle de cette image.

		Numéro de l’événement	pourcentage
un	Analyse de type sauvage	10 000
A'	Débris négatifs	4 381	43,80 %
A''	Doublet négatif	3 116	71,10 %
A'''	PI négatif	2 951	94,70 %
	LacZ-haut	16	0,54 %
	LacZ-faible	2 790	94,50 %
L	Analyse Axin2-LacZ	10 000
B'	Débris négatifs	4 218	42,2 %
B''	Doublet négatif	2 973	70,50 %
B'''	PI négatif	2 813	94,6 %
	LacZ-haut	553	19,70 %
	LacZ-faible	573	20,40 %

Table 1. Analyses quantitatives des stratégies de contrôle dans la figure 2.

Discussion

Des études de recherche indépendantes ont caractérisé une capacité de régénération limitée dans les cochlées néonatales^2,10,12,13. À l’aide d’une souris rapporteure de la GFP et d’une cytométrie en flux, White et ses collègues ont isolé des cellules de soutien cochléaire spécifiques et ont constaté qu’elles avaient des caractéristiques de cellules progénitrices¹².

Il a été démontré que la voie canonique Wnt marque les populations de cellules souches/progénitrices dans plu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de Pétri, polystyrène, stérile Geriner Bio-one 35 x 10 mm	VWR international	82050-540
BD Falcon Cell Strainers, stérile, BD Biosciences, bleu, 40 &mu ; m	VWR international	21008-949
Hanks' Solution saline équilibrée (HBSS). Solution avec du calcium, du magnésium et sans rouge de phénol, stérile	VWR international	45000-456
Tubes à centrifuger Cellstar, polypropylène, stérile, greiner bio-one, 50 ml	VWR international	82050-346
Tubes à centrifuger Cellstar, polypropylène, stérile, greiner bio-one, 15 ml	VWR international	82050-278 B-27
Supplément sans sérum (50x), liquide	Invitrogen	17504-044
N-2 (100x), liquide	Invitrogen	17502-048
bFGF, facteur de croissance des fibroblastes humain basique	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1, facteur de croissance analogue à l’insuline-1 de souris	Sigma-Aldrich	I8779
EGF, facteur de croissance épidermique humain	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium/Ham' s F-12 50/50 Mix : 1X, avec L-Glutamine et 15 mM HEPES	VWR international	45000-350
BD Falcon Tubes à fond rond, jetables, polystyrène, 12x75	VWR international	60819-295
Trypsine, 0,25 % (1X) avec EDTA 4Na, liquide	Invitrogen	25200-056
ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS	Eppendorf	22491245
Inhibiteur de la trypsine, soja, purifié	Worthington Biochemical	LS003570
BD Falcon 40um Spines cellulaires	BD Biosciences	21008-949
Plaques multipuits, polystyrène, Greiner Bio-One, plaques non traitées, 6 puits	VWR international	82050-846
Marker Gene FACS Blue LacZ beta-Galactosidase Detection Kit	Marker Gene Technologies	M0255