Isoler LacZ cellules exprimant des tissus de la souris oreille interne par cytométrie en flux

Résumé

La cytométrie en flux est un outil puissant permettant l'isolement et l'étude de populations cellulaires spécifiques. Ce protocole décrit les étapes d'isolement de cellules exprimant LacZ à partir de tissus cochléaires de souris transgéniques néonatales. Les cellules cochléaires dissociées ont été marquées à l'aide de substrats marqués par un fluorochrome de la β-galactosidase avant leur séparation par cytométrie en flux.

Résumé

L'isolement de types cellulaires spécifiques permet d'analyser des populations cellulaires rares, telles que les cellules souches ou progénitrices. Une telle approche pour l'étude des tissus de l'oreille interne présente un défi particulier en raison de la rareté des cellules d'intérêt et du faible nombre de modèles de souris transgéniques rapporteurs. Ici, nous décrivons un protocole utilisant des sondes marquées par fluorescence pour étiqueter de façon sélective les cellules positives pour LacZ provenant des cochlées néonatales.

La pathologie sous-jacente la plus fréquente de la surdité sensorielle est le dommage irréversible et la perte des cellules ciliées sensorielles cochléaires, nécessaires à la transformation des ondes sonores en impulsions nerveuses. Des données récentes suggèrent que les organes auditifs et vestibulaires de la souris abritent des cellules souches ou progénitrices qui pourraient avoir un potentiel régénératif^1,2. Ces découvertes justifient des investigations supplémentaires, notamment l'identification de types cellulaires spécifiques présentant des caractéristiques de cellules souches ou progénitrices. La voie de signalisation Wnt s'est révélée jouer un rôle essentiel dans le maintien des populations de cellules souches ou progénitrices dans plusieurs systèmes organiques^3-7. Nous avons récemment identifié des cellules exprimant Axin2 et sensibles à Wnt dans la cochlée néonatale, mais leur fonction reste largement inconnue⁸.

Pour mieux comprendre le comportement de ces cellules sensibles à la voie Wnt in vitro, nous avons mis au point une méthode permettant d'isoler les cellules exprimant Axin2 à partir de cochlées de souris rapporteuses Axin2-LacZ⁹. En utilisant la cytométrie en flux pour isoler les cellules positives pour Axin2-LacZ issues des cochlées de souriceaux, nous pouvons ensuite réaliser diverses expériences sur des cellules vivantes afin d'analyser leur comportement en tant que cellules souches ou progénitrices. Nous décrivons ici en détail les étapes de microdissection de la cochlée néonatale, de dissociation de ces tissus, de marquage des cellules positives pour LacZ à l'aide d'un substrat fluorogène, ainsi que de tri cellulaire. Des techniques de dissociation des cochlées en cellules individuelles et d'isolement des cellules cochléaires par cytométrie en flux ont déjà été décrites^2,10-12. Nous avons apporté des modifications à ces méthodes afin d'établir un protocole inédit d'isolement des cellules exprimant LacZ à partir de la cochlée néonatale.

Protocole

1. Microdissection de l'oreille interne

1. Préparer le microscope de dissection sous hotte en nettoyant les surfaces avec de l'éthanol à 70 % et en plaçant des blocs de glace.
2. Préparer 10 à 15 boîtes de Pétri de 35 mm en conditions stériles et les remplir à moitié (~2 ml) avec une solution saline équilibrée de Hank contenant du calcium (HBSS) stérile.
3. Préparer deux boîtes de Pétri de 35 mm en conditions stériles et les remplir à moitié (~2 ml) avec une solution tamponnée au phosphate 1x stérile (PBS).
4. Stériliser la pince fine dans un tube conique Falcon de 50 ml contenant de l'éthanol à 70 %.
5. Dans une pièce distincte de....

Discussion

Des études de recherche indépendantes ont caractérisé une capacité régénérative limitée au sein des cochlées néonatales^2,10,12,13. En utilisant des souris rapportant un gène GFP et la cytométrie en flux, White et ses collègues ont isolé des cellules de soutien cochléaires spécifiques et ont constaté qu'elles présentaient des caractéristiques de cellules progénitrices¹².

On a démontré que la voie canonique de Wnt marque les populations de cellules souches et progénitrices .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de Pétri, polystyrène, stérile Geriner Bio-one 35 x 10 mm	VWR international	82050-540
BD Falcon, Filtres à cellules, stériles, BD Biosciences, bleu, 40 μm	VWR international	21008-949
Hanks’ Solution saline équilibrée (HBSS). Solution avec calcium, magnésium et sans rouge de phénol, stérile	VWR international	45000-456
Tubes à centrifuger Cellstar, en polypropylène, stériles, Greiner Bio-One, 50 ml	VWR international	82050-346
Tubes de centrifugation Cellstar, en polypropylène, stériles, Greiner Bio-One, 15 ml	VWR international	82050-278
Supplément sans sérum B-27 (50x), liquide	Invitrogen	17504-044
Supplément N-2 (100x), liquide	Invitrogen	17502-048
bFGF, facteur de croissance des fibroblastes basique humain	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1, facteur de croissance ressemblant à l'insuline 1 provenant de souris	Sigma-Aldrich	I8779
EGF, facteur de croissance épidermique humain	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco’s Eagle modifié’s Milieu/Ham’mélange F-12 50/50 : 1X, avec L-glutamine et 15 mM HEPES	VWR international	45000-350
BD Falcon Tubes coniques jetables en polystyrène, 12x75	VWR international	60819-295
Trypsine, 0,25 % (1X) avec EDTA 4Na, liquide	Invitrogen	25200-056
ep Dualfilter TIPS 300 µL, 960 TIPS	Eppendorf	22491245
Inhibiteur de la trypsine, soja, purifié	Worthington Biochemical	LS003570
Filtres à cellules BD Falcon de 40 µm	BD Biosciences	21008-949
Plaques multipuits, polystyrène, Greiner Bio-One, plaques non traitées, 6 puits	VWR international	82050-846
Kit de détection de la bêta-galactosidase LacZ, Marqueur génétique FACS Blue	Technologies des gènes marqueurs	M0255