Mise à jour de levure-système à deux hybrides pour identifier les protéines qui interagissent avec le facteur de croissance progranuline

Résumé

Nous avons modifié la levure classique double-hybride en dépistage, un outil efficace dans l'identification génétique d'interactions protéiques. Cette modification raccourcit nettement le processus, réduit la charge de travail, et surtout, réduit le nombre de faux positifs. En outre, cette approche est reproductible et fiable.

Résumé

Progranuline (PGRN), aussi connu comme granulin epithelin précurseurs (GEP), est un facteur de croissance 593 acides aminés autocrine. PGRN est connue pour jouer un rôle critique dans une variété de processus physiologiques et les maladies, y compris l'embryogenèse précoce, ^une cicatrisation, l'inflammation ^{2, 3} et ⁴ défense de l'hôte. PGRN fonctionne également comme un facteur neurotrophique ^5, et des mutations dans le gène PGRN résultant en une perte partielle de la démence frontotemporale PGRN provoquer des protéines ^{6, 7.} Nos études récentes ont conduit à l'isolement du PGRN comme un régulateur important du développement du cartilage et de la dégradation ^8-11. Bien PGRN, découvert près de deux décennies auparavant, joue un rôle crucial dans de multiples conditions physiologiques et pathologiques, les efforts pour exploiter les actions du PGRN et de comprendre les mécanismes impliqués ont été considérablement entravés par notre incapacité à identifier ses liaison au récepteur (s). Pour répondre à cette question, nous avons développé une modiFied deux hybrides de levure (MY2H) approche fondée sur le plus couramment utilisé GAL4 base 2-hybride. Comparé avec les deux hybrides de levure écran conventionnel, MY2H raccourcit considérablement le processus de l'écran et réduit le nombre de faux clones positifs. En outre, cette approche est reproductible et fiable, et nous avons utilisé avec succès ce système à isoler les protéines de liaison d'appâts différents, y compris les canaux ioniques ^12, protéine de la matrice extracellulaire ^{10, 13} et ¹⁴ du facteur de croissance. Dans cet article, nous décrivons cette procédure expérimentale MY2H en détail en utilisant PGRN comme un exemple qui a conduit à l'identification de TNFR2 que le premier connu PGRN-récepteur associé ^{14, 15.}

Protocole

1. Informations générales

Les deux hybrides de levure système est une technique puissante génétique utilisé pour découvrir interactions protéine-protéine ^{16, 17.} Plusieurs types de deux systèmes hybrides, tels que les systèmes basés sur lexA, le système de recrutement Sos, et de bactéries ou de mammifères basés sur les cellules 2-hybrides, sont disponibles dans le commerce, ce document se concentre spécifiquement sur les modifications de la plus couramment utilisée basée GAL4 levure 2-hybride. Brièvement, la méthode est basée sur les propriétés de la protéine GAL4 de la levure qui se compose des domaines séparables respo....

Discussion

Deux hybrides de levure de dépistage s'est avéré être un outil efficace dans l'identification des interactions protéine ^{16, 17.} Comparé à d'autres approches pour identifier les protéines liant les partenaires, tels que biochimiques co-purification de protéines et de puces, deux hybrides de levure système est une approche sensible génétiques qui peuvent être utilisés pour le dépistage très grand nombre de séquences codantes dans une expérience relativement simple, dans De plus, il détecte les en in.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue
ProQuest système double-hybride	Invitrogen	10835
Milieu de croissance YPD	Clontech	630409
Agar YPD	Clontech	630410
Minimal SD Base de gélose	Clontech	630412
DO-Leu Supplément	Clontech	630414
-Leu/-Trp NE Supplément	Clontech	630417
-His/-Leu/-Trp/-Ura NE Supplément	Clontech	630425
3-amino-1 ,2,4-triazole (3AT)	Sigma-Aldrich	A8056
Luria Broth (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
Soniqué l'ADN de sperme de saumon	Stratagene	201190
Ampicilline	AMRESCO	0339
Sulfate de kanamycine	Invitrogen	11815-024
Efficacité sous-clonage ™ ™ DH5a cellules compétentes	Invitrogen	18265-017
Trizma ®, la base	Sigma-Aldrich	T6066
L'acétate de lithium	Sigma-Aldrich	L4158
Acide éthylènediaminetétraacétique	Sigma-Aldrich	ED
Membrane de nitrocellulose	Bio-Rad	162-0115
10 cm de boîte de Pétri	ITI scientifique	CT-903
Incubateur (30 ° C)	ATR (Ecotron)