L'isolement des cellules de souris poumon dendritiques

Résumé

Une préparation hautement purifiée de cellules de souris pulmonaires dendritiques est décrite. Un accent particulier est donné à l'isolement de sous-ensemble de cellules dendritiques conventionnelles.

Résumé

Cellules dendritiques pulmonaires (DC) jouent un rôle fondamental dans la détection des pathogènes envahisseurs ^1,2 ainsi que dans le contrôle des réponses tolérogènes ³ dans les voies respiratoires. Au moins trois sous-ensembles principaux de cellules dendritiques pulmonaires ont été décrites chez la souris: DC conventionnelles (CDC) ^4, DC plasmacytoïdes (pDC) ⁵ et le tueur de l'IFN-production DC (IKDC) ^6,7. Le sous-ensemble CDC est le sous-ensemble DC les plus éminents dans les poumons ^8.

Le marqueur commun connus pour identifier des sous-DC est CD11c, un type que je transmembranaire intégrines (β2) qui est également exprimé sur les monocytes, les macrophages, les neutrophiles et des cellules B ^9. Dans certains tissus, en utilisant comme marqueur CD11c pour identifier la souris DC est valable, comme dans la rate, où la plupart des cellules CD11c ⁺ représentent le sous-ensemble des CDC, qui exprime des niveaux élevés de l'complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II). Toutefois, le poumon est un tissu plus hétérogène, où secôté des sous-ensembles DC, il ya un pourcentage élevé d'une population de cellules distinctes qui exprime des niveaux élevés de CD11c bout de faibles niveaux de CMH-II. Basé sur sa caractérisation et surtout sur ​​l'expression de ses F4/80, un marqueur des macrophages spléniques, le CD11c ^Salut CMH-II de la population ^lo cellules du poumon a été identifié comme les macrophages pulmonaires 10 et plus récemment, comme un précurseur potentiel DC ^11.

Contrairement à la souris PDC, l'étude du rôle spécifique de la CDC dans la réponse immunitaire pulmonaire a été limitée en raison de l'absence d'un marqueur spécifique qui pourrait aider dans l'isolement de ces cellules. Par conséquent, dans ce travail, nous décrivons une procédure pour isoler hautement purifiée de souris pulmonaires CDC. L'isolement des sous-ensembles DC pulmonaires représente un outil très utile afin de mieux connaître la fonction de ces cellules en réponse à des agents pathogènes des voies respiratoires ainsi que les facteurs environnementaux qui peuvent déclencher la réponse immunitaire de l'hôte dans les poumons.

Protocole

1. Perfusion pulmonaire et la suspension seule cellule

1. Euthanasier la souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine mélange anesthésique (en mg / souris kétamine 1.8, xylazine 0,19) et une exsanguination par la veine fémorale
2. Exposer la cavité thoracique en coupant et en tirant doucement en arrière la peau externe du péritoine. Procéder à l'ouverture du diaphragme par la coupe de la cage thoracique afin d'exposer à la fois le cœur et les poumons.
3. Perfuser délicatement les poumons en utilisant une seringue de 5 ml remplie avec de l'EDTA-HBSS (1mM EDTA en calcium / magnésium sans HBSS). Connecter une aiguil....

Discussion

L'isolement de la souris pulmonaires DC est une technique importante pour l'étude d'un large éventail de stimuli respiratoires. Le processus d'obtention de ces cellules comprend des étapes critiques qui empêchent la perte de cellules ainsi que la viabilité des cellules et la pureté. Perfusant le poumon avant la collecte aidera à éliminer toutes les cellules périphériques ainsi que de réduire les érythrocytes contaminant. L'utilisation de la dissociation peut être automatisé advanteogus quand un grand.......

Matériaux

Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Tampon de lyse ACK	Invitrogen	D6-0005DG
Anti-souris CD11c (HL3)	BD Pharmingen	5580979	PE-Cy7 conjugués
Anti-souris IA / IE (269)	BD-Pharmingen	553623	Conjugué au FITC
Collangenase type 1A	Sigma	9891-500MG
Crépines cellulaire	BD Falcon	352340, 352360
CD11c (N418) Microbilles	Miltenyi	130-052-001
DNase I	Sigma	D5025-150KU
Hank solution saline équilibrée	Invitrogen	14170
Solution tampon HEPES	Invitrogen	15630
Boîtes de Pétri de 60 mm	BD Falcon	351016
GentleMACS ™ C tubes	Miltenyi	130-093-237
Douceur dissociateur MACS	Miltentyi	130-093-235
Automacs-Pro ™	Miltenyi	130-092-545
FASCS Aria	BD