Cartographie Diffusion moléculaire dans la membrane plasmique par multiple-cible de Recherches (MTT)

Summary

Multiple-Cible Le traçage est un algorithme maison développé pour le suivi individuel au sein de molécules marquées de la membrane plasmique des cellules vivantes. Efficacement détecter, évaluer et le traçage des molécules au cours du temps à haute densité de fournir un outil convivial, outil exhaustif visant à étudier la dynamique des membranes nanométriques.

Abstract

Notre objectif est d'obtenir une description complète des processus moléculaires survenant au niveau des membranes cellulaires dans différentes fonctions biologiques. Nous visons à caractériser l'organisation complexe et dynamique de la membrane plasmique au niveau d'une seule molécule, en développant des outils d'analyse dédiés à une particule de suivi (SPT) à haute densité: Multiple-Cible Tracing (MTT) ^1. Simple-molécule vidéomicroscopie, offrant milliseconde et nanométrique résolution ^1-11, permet une représentation détaillée de ^12-14 organisation de la membrane par cartographier de façon précise des descripteurs tels que la localisation cellulaire des récepteurs, la mobilité, l'accouchement ou des interactions.

Nous avons revisité SPT, à la fois expérimentalement et algorithmiquement. Les aspects expérimentaux, dont l'optimisation de configuration et d'étiquetage des cellules, avec un accent particulier sur la densité pour atteindre l'étiquetage le plus élevé possible, afin de donner un aperçu dynamique de la dynamique moléculaires de las il se produit dans la membrane. Questions algorithmiques concernés chaque étape utilisée pour la reconstruction de trajectoires: la détection des pics, l'estimation et la reconnexion, abordés par des outils spécifiques de ^15,16 analyse d'image. La mise en œuvre de déflation après la détection permet pics sauvetage initialement masqué par des pics voisins, plus forts. Fait à noter, l'amélioration de la détection influe directement sur la reconnexion, en réduisant les écarts dans les trajectoires. Les performances ont été évaluées à l'aide de Monte-Carlo pour la densité de l'étiquetage différents et des valeurs de bruit, qui représentent généralement les deux limitations majeures pour les mesures parallèles à haute résolution spatiotemporelle.

La précision nanométrique ¹⁷ obtenues pour des molécules simples, en utilisant soit successives marche / arrêt optique photocommutation ou non linéaire, peut fournir des observations exhaustifs. C'est la base de méthodes nanoscopie ^{17 de} telle sorte que TEMPÊTE ^18, PALM ^{19,20, 21} ou RESOLFT STED ^22,23, which peut souvent exiger des échantillons d'imagerie fixes. La tâche essentielle est la détection et l'estimation de la diffraction limitée pics émanant de simples-molécules. Par conséquent, fournir des hypothèses adéquates telles que la manipulation une précision constante de position au lieu du mouvement brownien, le MTT est carrément adapté pour des analyses nanoscopiques. En outre, le MTT peut fondamentalement être utilisé à n'importe quelle échelle: non seulement pour les molécules, mais aussi pour les cellules ou les animaux, par exemple. Par conséquent, le MTT est un algorithme de suivi puissante qui trouve des applications à l'échelle moléculaire et cellulaire.

Protocol

Dans cette vidéo, nous présentons une pleine expérience unique de suivi des particules, en utilisant quantiques points destinés à un récepteur membranaire spécifique. L'objectif principal de cette expérience consiste à discriminer les différents types de comportements de diffusion moléculaire mesurées au sein de la membrane plasmique des cellules vivantes. En effet, les mouvements moléculaires qui se posent sur ​​la membrane peut généralement s'écarter de la diffusion brownienne en étant linéairement ordonné ou confiné à l'intérieur nanodomaines ^26-29, par exemple. Nous visons à la fois à la suite que de nombreux récepteurs que techniquement possible, de donner un aperçu de la variété résultant de la dynamique qui se produisent au sein de la membrane d'une cellule vivante. Ce devrait finalement permettre à déchiffrer les mécanismes qui régulent la signalisation récepteurs de surface cellulaire.

1. Culture cellulaire

1. Préparer l'échantillon cellulaire: utiliser adhérentes cellules COS-7, qui expriment le récepteur endogène facteur de croissance épidermique (EGFR) ^30. Quandtravailler avec des cellules vivantes sans antibiotiques assurez-vous de ne pas avoir latente sous-détectable de contamination en utilisant les bonnes techniques stériles en tout temps pendant la préparation.
2. Cultiver les cellules dans un milieu complet (DMEM avec 10% de sérum de veau, 1% de glutamine, HEPES 1% et pyruvate de sodium à 1%, voir tableau des réactifs spécifiques ci-dessous), à 37 ° C avec 7% de CO _2, en prenant soin de les avoir dans sous-confluente, la croissance exponentielle avant de les répandre dans Lab-Tek.
3. Le jour avant l'expérience, répartis 5.000 cellules / puits à 8-bien chambres (Lab-Tek) et incuber pendant la nuit. Comptage des cellules assure une densité constante de cellule, d'où un ratio reproductible quantiques points par cellule.

2. Marquage des cellules

Préparer quantiques points avec un revêtement spécifique. Quantum-points sont des nanoparticules fluorescentes composées de semi-conducteurs. Ces nanoparticules présentent un grand intérêt car ils sont très lumineuses et photostable contre classique^31,32 sondes fluorescentes, ce qui permet la réalisation d'un signal approprié à bruit (SNR) pour l'imagerie seule molécule.

1. Avant l'expérience, de produire des fragments Fab contre EGFR de la lignée cellulaire hybridome (mAb 108, ATCC HB-9764), par digestion à la papaïne, comme décrit précédemment ^21.
2. Conjugué Fab avec de la biotine, selon les instructions du fabricant (EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotinylation Kit; Thermo Scientific, figure 1A.).
3. Utilisez quantiques points fonctionnalisés avec de la streptavidine (Invitrogen) et émettant à 605 nm (longueur d'onde d'émission optimale pour la brillance, la détection et la séparation de l'autofluorescence cellulaire).
4. Préparer la solution de marquage dans un milieu complet (voir le tableau des réactifs spécifiques), afin de saturer les streptavidines présents autour des points quantiques, ainsi que pour prévenir l'agrégation et la liaison non spécifique aux cellules et à la lamelle.
5. Préparer deux solutions intermédiaires:un avec quantique points-streptavidine et une autre avec Fab biotinylé, chacun à 20 nM.
6. Mélanger un volume égal de ces deux solutions: mélanger les points quantiques avec Fab en ratio 1:1 pour obtenir une concentration finale de travail de 10 nM Fab: quantiques points complexe. En utilisant un ratio équimolaire favorise la formation de mono-fonctionnalisés complexes composées d'un des points quantiques et un fragment Fab biotinylé. Cela favorise l'étiquetage monovalent, limitant les observations des artefacts dus à des récepteurs de réticulation ^33,34.
7. Incuber pendant 15 minutes à 25 ° C, en utilisant un agitateur à 1200 rotations par minute pour empêcher l'agrégation. Le mélange est alors prêt à être utilisé sur des cellules vivantes.
8. Incuber les cellules dans 100 ul de mélange pendant 5 minutes à 37 ° C avec 7% de CO _2.
9. Laver les cellules avec le milieu de l'imagerie non-autofluorescente (tampon HBSS, HEPES 1%, voir tableau des réactifs spécifiques) pré-chauffé à 37 ° C.
10. Retirez délicatement l'excédent des étiquettes pour éviter des Nations Uniesnécessaire de gâcher le SNR par non liée, de mise au point quantique-points, par beaucoup laver chaque puits avec du milieu de l'imagerie, typiquement 5 fois à la température ambiante, avec au moins 5 minutes de retard avant le dernier lavage.

3. Configuration optique

La configuration vidéo-microscopie est composé de quatre grandes parties:

1. Un microscope inversé avec un cube fluorescence spécifique (FF01-457/50 d'excitation, FF495-DI02 dichroïque, et FF01-617/73 filtres d'émission, Semrock) et une ouverture numérique élevée (1.3 ou 1.49) à immersion 100x objectif.
2. Un 100 W à lampe au mercure (couplée à la microscopie par une fibre optique, en évitant interférer avec la thermorégulation).
3. Un 512 x 512 pixels de sensibilité EMCCD appareil afin de réaliser une suffisante SNR.
4. Un incubateur pour conserver les échantillons biologiques à 37 ° C pendant l'expérience.

4. Acquisition

1. Sélectionnez les cellules isolées et le bien-propagation. Cettefavorise l'extension de la belle, lamellipodes plat, la mieux adaptée à regarder pour un mouvement planaire des molécules membranaires.
2. Évaluer l'état physiologique cellulaire par son aspect à la fois en lumière transmise et la fluorescence: le trafic vésiculaire intense, absence de signes nécrotiques ou apoptotiques, une autofluorescence faible, et la moyenne-forte en matière d'étiquetage des points quantiques (typiquement jusqu'à 1000 points quantiques par cellule, voir Fig. 1B, C).
3. Sélectionnez une densité élevée d'étiquetage, ce qui est essentiel pour la surveillance simultanée des récepteurs autant que possible. Ceci est en fait limité à la fois par des facteurs physiologiques (expression à la surface, l'accessibilité épitope, mouvement latéral) et les paramètres algorithmiques (non-cumul des fonctions d'étalement de point (PSF), même en tenant compte flou dus au mouvement, pour permettre une bonne détection et la reconnexion).
4. Pour chaque cellule, d'abord acquérir une image de champ clair (de préférence en utilisant DIC, si elle est disponible) qui peuvent en outre permettre la vérification de l'aspect des celluleset les limites spatiales de l'lamellipodes.
5. Sauvegarder cette image en utilisant le même nom que la vidéo-pile (comme cell1.tif & cell1.stk par exemple), dans un sous-dossier nommé dic, puisque, avec ces conventions, l'algorithme peut automatiquement retrouver l'image correspondante pour les chaque pile.
6. Acquérir de 1 à 3 vidéos par cellule, en permanence, généralement à 36 ms taux, le taux le plus rapide possible en plein cadre avec cet appareil photo. Cependant, on peut acquérir à des fréquences plus élevées, jusqu'à 1 ms taux, à l'aide CCD dédié avec une sensibilité accrue et / ou moins de pixels. La technologie de transfert de trame fournit retard négligeable entre les images.
7. Amélioration se multiplient électronique doit toujours être réglé au maximum (juste en dessous de la saturation, le cas échéant) afin de permettre d'atteindre la sensibilité seule molécule, avec un nombre suffisant de SNR, au moins au-dessus de 20 dB (pour la détection de pointe efficace ^1), généralement autour de 25-30 dB.
8. Typiquement acquérir 300 images par vidéo, le péchétrajectoires sexies sont reconstruits plus de ~ 100 images en moyenne, pour la plupart limités par de longues événements clignotantes. La fréquence vidéo et la longueur peut être adaptée pour une mesure donnée, ce qui pourrait nécessiter plus de traces, par exemple.

5. Analyse MTT

1. Sélectionnez le chemin vers le répertoire contenant les fichiers vidéo d'évaluer un ensemble de données avec Matlab ou Octave.
2. Pour commencer l'analyse entièrement automatisée ^1,35, tapez la commande detect_reconnex23 dans Octave, ou MTT23i dans Matlab. Ce programme est pour "la version 2.3, avec une interface utilisateur" et est disponible pour téléchargement, avec la version précédente 2.2. Il affiche d'abord une interface graphique liste de tous les paramètres utilisés, comme indiqué dans la Fig. 2.

6. Les résultats représentatifs

MTT analyse automatiquement chaque enregistreur vidéo, de livrer des traces de cibles détectées et estimées, complétées par d'autres dansvestigations, tels que la détection de confinement. Cela permet en fin de compte des traces de cartographie sur les images de cellules (Fig. 1C & 3).

Description de MTT

L'analyse MTT coeur est effectuée sur chaque trame, en invoquant 3 tâches principales (Fig. 3):

1. Détection de la présence ou l'absence d'une cible (points quantiques), dans un coulissement sous-région successivement centrée autour de chaque pixel, où deux hypothèses sont comparées: présence soit d'un signal, avec la PSF modélisé comme un pic gaussien bidimensionnel , ou seulement du bruit, en utilisant un seuil assurant alarme de basse assez fausse, à moins d'un parasite de détection par image. Cela conduit à une carte de probabilité de détection. Chaque maximum local est considéré comme une cible putative, assurant que son niveau de probabilité est supérieure à une valeur minimale, fixé en fonction de la probabilité de fausse alarme souhaitée (PFA). Cette limite est fixée assez bas pour discriminer efficacement signaux de bruit, en évitant au mieux les détections parasites (PFA de 10 ^-6 par défaut, pour assurer au moins une erreur dans 512 x 512 pixels des images), tout en permettant une probabilité suffisamment élevée de détection, pour atteindre le ¹ prédite théoriquement optimale. Notez que l'exigence d'utiliser une sous-région implique que les bords de l'image (3 pixels, pour une fenêtre par défaut de 7 x 7 pixels) ne peut pas être évalué.
2. Estimation, pour chaque cible détectée, des paramètres pertinents, tels que sous-pixel de position et l'intensité du signal. Pour chaque cible détectée, une des moindres carrés de Gauss-Newton ajustement est ensuite effectuée pour estimer la position, la largeur et la hauteur de la gaussienne détecté. Ceci fournit notamment la position de sous-pixel du colorant (10 à 20 nm pour la précision des valeurs SNR typiques et des colorants immobiles ou lentement diffusant, croissant jusqu'à environ 100 nm pour les colorants de diffusion à 0,1 um ^{2 /} s).
3. Reconnexion des nouveaux objectifs avec letraces déjà construites au cours des trames précédentes. L'ensemble de nouvelles cibles est identifié avec l'ensemble des traces précédentes. A cet effet, afin d'attribuer à chaque cible à une trace, si possible, toutes les informations statistiques disponibles obtenu à l'étape de détection est utilisé, non seulement la position, mais aussi l'intensité, la largeur, de clignoter et les statistiques associées. Par conséquent, les objectifs ne sont pas seulement affecté à la plus proche de trace: en cas de traces de passage, l'intensité, la vitesse, la largeur et clignotants seront pris en considération. Cette offre le score de reconnexion statistiquement optimale. Cette stratégie permet d'éviter, si possible, de polarisation de la reconnexion à l'égard des plus proches voisins.

Pics détectés peuvent être a posteriori rejetée si leur estimation ou reconnexion échoue. Un test spécial s'occupe de la détection de nouveaux sommets, ce qui lancerait de nouvelles traces. Ce test utilise une plus stricte PFA (10 ^-7), depuis un pic reconnecter à une trace peut être interprété de facto comme un o de validation f sa pertinence (ce critère étant par définition ne s'applique pas à de nouveaux sommets).

Analyse de la trajectoire

Possible confinement transitoire est ensuite évalué par une fonction inversement proportionnelle à la diffusion locale ^24-29. L'application d'un seuil permet de définir confinés ou non épisodes. En itérant ces cours toutes les traces, nous pouvons cartographier la dynamique des membranes, en termes de confinement transitoire / ralentir les événements. Cela peut être alternativement représentés en utilisant le binaire ou les valeurs discrètes de cet indice de confinement.

Par défaut, MTT effectue automatiquement ces travaux, pour économiser 8 paramètres de pointe dans un fichier texte: numéro de châssis, i et la position j, l'intensité du signal, le rayon, le décalage et cligner des yeux, pour chaque trame vidéo (groupe de 7 lignes) et trace (colonne) . Ces paramètres de sortie peuvent être rechargées dans Matlab ou Octave en utilisant le script fread_data_spt pour approfondir l'analyse des traces ou des intensités de signal soit, comme en témoigne la "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt" script> MTT_example en annexe.

D'autres analyses conduisent à la carte des traces sur chaque cellule (Fig. 1C & 3) et à assurer une distribution d'histogramme pour les paramètres pertinents (tels que l'intensité des pics, SNR ou des valeurs de diffusion locales). Pour chaque fichier, la moyenne et l'écart-type de chaque paramètre sont enregistrées dans un fichier texte, avec une image des histogrammes. Distributions logarithmiques, tels que des déplacements carrés r ^2, conduire à la moyenne géométrique. Le coefficient de diffusion D est calculée à partir d'un ajustement linéaire au cours des cinq premiers points de la courbe des TMS. Ces valeurs donnent un aperçu d'une expérience impliquant pour la cinétique de réactions cellulaires par exemple ou des traitements pharmaceutiques / enzymatique affectant l'organisation des membranes. Depuis MTT est un code open-source, cet aspect peut être facilement adaptée à toute enquête dédiée.

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Figure 1. Surveillance dynamique des récepteurs membranaires par MTT. Composants de la membrane (A), comme l'EGFR, sont étiquetés avec des points quantiques couplés à des fragments Fab biotinylé (dessin schématique avec mise à l'échelle à peu près correcte de chaque molécule). (B) typique image fluorescente acquise à partir d'un direct cellule COS-7, avec le temps d'exposition de 36 ms, représentant limité par diffraction des pics correspondant à des récepteurs individuellement étiquetés. (C) de sortie de l'analyse MTT affichage des trajectoires reconstituées des récepteurs, des superposées sur l'image en fond clair de la cellule.

Figure 2. Paramètres d'entrée MTT. Exécution MTT23i ouvre une interface utilisateur graphique liste de tous les paramètres d'entrée, les noms et les valeurs par défaut, tel que décrit dans notre publication précédente ^1. Dans les paramètres de l'algorithme, l'espace et le temps (fenêtres de recherche, le rayon de pointe, la diffusion maximale et clignotant) sont en dimension standard, les unités pixels et des cadres. Calibrages peuvent être appliquées a posteriori pour convertir les résultats de sortie. Les valeurs par défaut, correspondant à une 512BFT Cascade avec un grossissement de 100x, sont la taille des pixels: 156 nm / pxl et de retard de trame: 36 ms / frame.

Les enquêteurs devraient optimiser quelques paramètres critiques, tels que le coefficient de diffusion maximale prévue ("Diff max") et un maximum de disparition clignote ("T _off"). Ces deux limites spatiales et temporelles sont presque les seuls qui ont besoin d'être reconsidérée pour une condition donnée expérimentale, les autres étant des valeurs par défaut robustes. Par exemple, le nombre de fausses alarmes est directement réglé pour assurer moins d'une erreur pour un million de pixels, donc moins d'un par image, ce qui est satisfaisant dans la plupart des cas. Tous les paramètres sont sauvegardés dans un fichier texte dans le dossier de sortie, permettant aux utilisateurs de vérifier a posteriori les paramètres ont été utilisés pour l'analyse.

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Figure 3. Les principales étapes de l'analyse MTT. Partir d'une pile expérimentale d'images de fluorescence, les pics sont séquentiellement et automatiquement détectés, estimée par un ajustement gaussien et reconnecté sur des trames (première gamme d'opérations, la partie supérieure de l'organigramme). Les traces peuvent encore être analysés pour l'accouchement présumé, par exemple, conduisant finalement à une carte dynamique de descripteurs pertinents (deuxième gamme d'opérations, la partie inférieure).

Figure 4. Valence d'étiquetage n'a pas d'incidence MTT. Pour évaluer le biais possible introduit par l'étiquetage polyvalent artéfactuelle, l'analyse MTT a été réalisée pour suivre l'EGFR endogène étiquetés en utilisant 2 systèmes différents, pour générer et analyser des cartes de trajectoires. (A) Récepteur ont été marqués avec biotinylé Fab et quantique dots605-streptavidine, tel que décrit dans le protocole.Dans ce cas, la valence de multi-quantique-points et streptavidines peut entraîner dans le couplage de plusieurs récepteurs à un seul colorant. (B) Récepteur ont été marqués avec Fab directement couplé à un colorant organique, Atto647N. Dans ce cas, un fragment Fab, d'où un récepteur, peut être couplé à plus d'un colorant. (C) Carré moyen de déplacement (TMS) la courbe a été calculée pour toutes les traces pour chaque cellule, étiquetés, soit avec des points quantiques ou des colorants ATTO (graphiques gauche et droite, respectivement). Les coefficients de diffusion ont été calculés par régression linéaire sur les cinq premiers points de la MSD (ligne rouge pointillée). Chaque régime d'étiquetage conduit à des valeurs de diffusion similaires (graphique central). Qdot: quantique dots605 (n = 5 cellules), Atto: Atto647N (n = 7 cellules), ns: non significatif (test t de Student valeur p> 0,05).

Discussion

Dans une particule de suivi, à côté des éléments de cellules et la microscopie, l'analyse représente une partie substantielle de l'ouvrage. Cela répond à l'algorithme utilisé pour effectuer les trois tâches principales: la détection, l'estimation et la reconnexion des pics sur chaque trame. Mais l'aspect conséquente de ce travail réside dans l'élaboration de l'algorithme lui-même, qui peut être adapté pour toute nouvelle enquête dédiée, essentiellement pour les dernières, les étapes supplémen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Quantité
Cos-7 lignée cellulaire	ATCC	CRL-1651	5000 cellules par puits
HBSS sans Ca 2 +	GIBCO	14175	1 ml
0,05% d'EDTA trypsine	GIBCO	25300	1 ml
8-même Lab-tek	NUNC	155441	1
Qdot-605 streptavidine	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Fab biotinylé (pour la synthèse de Fab, voir référence 21)
Fab de mAb 108	ATCC	HB-9764	200 pg
NHS-biotine	Thermo Scientific	21435	18,5 pg
Remplissez moyennes
DMEM	GIBCO	41965	500 ml
Sérum fœtal bovin	SIGMA	F7524	50 ml
L-glutamine	GIBCO	25030	5 ml
HEPES	GIBCO	15630	5 ml
Pyruvate de sodium	GIBCO	11360	5 ml
Imagerie moyennes
HBSS avec Ca 2 +	GIBCO	14025	25 ml
HEPES	GIBCO	15630	250 pi