Analyse de la migration des crêtes neurales et la différenciation par la Croix-espèces transplantation

Résumé

Une approche pour l'analyse des migrations et le destin éventuel de cellules aviaires de la crête neurale chez la caille-poulet embryons chimériques est décrite. Cette méthode est une technique simple et directe pour le traçage des cellules de la crête neurale au cours de la migration et la différenciation qui seraient autrement difficiles à distinguer au sein d'un embryon de poulet non manipulée.

Résumé

Embryons aviaires fournir une plate-forme unique pour l'étude de nombreux vertébrés processus de développement, en raison de la facilité d'accès des embryons dans l'œuf. Chimériques embryons aviaires, dans lequel le tissu des bailleurs de fonds de caille est transplanté dans un embryon de poulet in ovo, combiner la puissance de l'étiquetage génétique indélébile de populations de cellules avec la facilité de manipulation présenté par l'embryon aviaire.

Quail-chiches chimères sont un outil classique pour tracer migratoires des cellules de la crête neurale (CCN) ^1-3. CCN sont une population de passage migratoire des cellules dans l'embryon, qui sont originaires de la région dorsale de la ⁴ du tube neural en développement. Ils subissent une transition épithélio-mésenchymateuse et migrent vers d'autres régions de l'embryon, où ils se différencient en différents types cellulaires, y compris le cartilage ^{5-13, 11,14-20} mélanocytes, les neurones et cellules gliales ^21-32. CCN sont multipotentes, et leur sort ultime est influencéeexpérimentés par 1) la région du tube neural dont ils sont issus le long de l'axe rostro-caudale de l'embryon ^11,33-37, 2) des signaux provenant des cellules voisines de leur migration ^38-44, et 3) le micro-ultime de leur destination à l'intérieur de l'embryon ^45,46. Suivre ces cellules à partir de leur point d'origine à du tube neural, à leur position finale et le sort au sein de l'embryon, donne un aperçu important dans les processus de développement qui régulent structuration et de l'organogenèse.

Transplantation des régions complémentaires du tube neural des bailleurs de fonds (homotopes greffage) ou différentes régions du tube neural des bailleurs de fonds (hétérotopique greffage) peut révéler des différences dans pré-spécification de CCN le long de l'axe rostro-caudal ^2,47. Cette technique peut être en outre adapté pour transplanter un compartiment unilatérale du tube neural, de telle sorte que d'un côté est dérivé du tissu du donneur, et les restes côté controlatéral imperturbable dans l'embryon d'accueil, yiElding un contrôle interne au sein du même échantillon ^2,47. Il peut également être adapté pour la transplantation de segments du cerveau chez les embryons plus tard, après HH10, lorsque le tube neural antérieur a fermé ^47.

Nous rapportons ici les techniques pour générer des cailles-chiches chimères par transplantation du tube neural, qui permettent de tracer des CNC migratoires provenant d'un segment distinct du tube neural. Spécifique à l'espèce marquage des cellules dérivées des bailleurs de fonds avec l'anticorps spécifique à la caille QCPN ^48-56 permet au chercheur de distinguer des donateurs et des cellules hôtes au point de fin d'expérimentation. Cette technique est simple, peu coûteux, et a de nombreuses applications, y compris le sort de cartographie, la lignée cellulaire de traçage et l'identification des pré-patterning événements le long de l'axe rostro-caudal ^45. En raison de la facilité d'accès à l'embryon aviaire, la technique de greffe caille-poussin peut être combiné avec d'autres manipulations, y compris mais non limité à ⁴ ablation lentille0, l'injection de molécules inhibitrices ^57,58, ou la manipulation génétique par électroporation de plasmides d'expression ^59-61, afin d'identifier la réponse de certains flux migratoires de CCN à des perturbations dans le programme de développement de l'embryon. En outre, cette technique de greffage peut aussi être utilisé pour générer d'autres embryons interspécifiques chimériques tels que la caille-canard chimères d'étudier la contribution de la CCN à la morphogenèse cranio-faciale, ou la souris-chiches chimères de combiner la puissance de la génétique de la souris avec la facilité de manipulation de l'embryon aviaire ^62.

Protocole

1. Incuber poussin et oeufs de caille à l'étape désirée

Pour HH9 embryons, les durées d'incubation typiques vont de 29-33 heures à 38 ° C. ⁶³

1. Laver les débris sur les oeufs avec l'eau tiède.
2. Disposer des œufs de poule sur le plateau horizontalement. Marquer le côté orienté vers le haut avec le crayon; ce correspond à la région où l'embryon est localisé. Incuber oeufs de caille extrémité émoussée vers le haut.
3. Lieu à 38 ° C incubateur humidifié. Tournez à bascule fonction.

2. Préparez les œufs pour le fenêtrage et la dissection

1. Retirer les oeufs de l'incubateur, et stériliser les sommets avec de l'éthanol 70%. Il est préférable de vaporiser sur l'éthanol et l'essuyer rapidement avec une serviette en papier ou Kimwipe afin d'éviter toute absorption de l'éthanol à travers la coquille.
2. Oeuf de poule en place sur le titulaire individuel de l'œuf (nous utilisons une boîte de Pétri avec des serviettes en papier pliées, par exemple, "Kimwipes"). En utilisant des pinces AA, appuyez sur une petite hole dans la surface supérieure de la coquille d'oeuf à l'extrémité pointue de l'oeuf.
3. Retirer de 1,5 3mL de la lumière albumine de l'œuf de poule avec une aiguille hypodermique G 18 ½ et 5 mL. Il est préférable d'insérer l'aiguille à la verticale dans le trou, avec le biseau orienté le bout pointu de l'œuf (figure 2A). De cette façon, lorsque l'albumine est retiré, il ya peu de risque de un endommagement accidentel du jaune d'oeuf par aspiration. Jeter l'albumine. Cette étape réduira le jaune et l'embryon dans l'œuf afin de permettre une fenêtre à ouvrir dans la coquille.
4. Essuyez le trou avec de l'éthanol à 70% tel que décrit ci-dessus et sceller avec du scotch. Il est important que la coquille qui entoure le trou est complètement dépourvu d'albumine et sec ou de la colle ne sont pas étanches.
5. Avec la pince AA, appuyez sur un autre trou dans la surface supérieure marquée de l'œuf horizontale, pas tout à fait au sommet. Prenez soin de ne pas laisser les pinces aller trop loin à travers la coquille pour éviter d'endommager le jaune ou l'embryon.
6. DansSert un côté de la pince iris incurvées dans le trou parallèle à la coque oeufs. Pincement vers le bas sur la coque, de travailler dans un mouvement circulaire pour briser un 2 ~ cm de diamètre dans la fenêtre dans la coquille d'oeuf de poulet. Jeter la coquille enlevée. Alternativement, recouvrir la surface supérieure de l'œuf avec du ruban d'emballage et d'utiliser une paire de ciseaux pour découper la fenêtre. Cela réduit le risque de débris coquille de tomber dans l'œuf. L'embryon doit apparaître comme un disque opaque sur le dessus du jaune. Jeter les œufs non fécondés (identifié par petite tache blanche sur la surface de jaune d'oeuf, ou l'absence de blastoderme).
7. Injecter une petite quantité de l'encre de Chine (dilué à 1:10 dans la solution Ringer stérile contenant "Pen / Strep« antibiotique: la concentration finale de 100 pg / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine) sous le blastoderme pour aider à la tenue de l'embryon. Utilisez une seringue de 1 ml et 26 ½ aiguille hypodermique G, plié en angle de 45 ° à la base de l'aiguille, avec le biseau vers le haut, ou alternativement, un may utiliser un tire Pasteur en verre pipette et un appareil pipetage à la bouche (porter une protection oculaire lors de la flexion aiguille hypodermique ou de casser l'aiguille de verre). Percer la membrane du jaune l'extérieur du périmètre du blastoderme et glisser la pointe de l'aiguille sous l'embryon, à proximité de la surface du jaune, mais pas dans les couches embryonnaires (figure 2B). Injecter simplement assez d'encre pour décrire l'embryon, puis retirer avec précaution l'aiguille (figure 2C). L'injection de trop d'encre peut entraîner la mort des embryons. Il est important de ne pas injecter des bulles d'air sous l'embryon, comme cela peut être une source de contamination. NB: une solution de Ringer tous utilisé dans ce procédé est stérilisé et contient pénicilline / streptomycine tel que défini ci-dessus. Phosphate stérile (PBS) est également une alternative acceptable à la solution de Ringer à toutes les étapes de ce protocole.
8. Stade de l'embryon en fonction de Hamburger et Hamilton ⁶³ et enregistrer la scène sur la coquille à l'encre indélébile ou d'un crayon. Les étages sont mieux évaluées en vertu de stèreomicroscopy, avec fibre optique sources «Gooseneck» de lumière qui ont une charge thermique limitée.
9. Appliquer 2-3 gouttes solution chaude Ringer stérile à la surface de l'embryon à empêcher la contamination et la déshydratation. Sceller temporairement la fenêtre de parafilm tendue sur la surface de l'oeuf.
10. Répétez les étapes 02.02 à 02.09 avec tous les œufs de poulet avant de commencer les expériences de transplantation.
11. Depuis embryons de caille ne sont utilisés que pour les tissus des donateurs, dans les étapes 2.2 à 2.9 ovo peut être omis. Pour la préparation ovo ex d'embryons donateurs, oeufs de caille sont incubés côté non tranchant et a ouvert dans cette région avec des pinces courbes de révéler l'embryon. Avec des ciseaux de dissection, faire quatre coupes en forme d'un carré à travers la membrane vitelline et blastoderme en dehors de l'embryon (assurez-vous que toutes les coupes de répondre). En utilisant une pince courbes iris, pincez doucement une arête de coupe et soulever l'embryon de l'oeuf et de le transférer à une solution de Ringer dans une boîte de Pétri. Alternativement, on peut utiliser la courbed iris Pince à lever l'embryon excisé du dessous, ou une cuillère embryon ou d'une pipette de transfert en plastique couper à travers la partie la plus large du cylindre, peut être utilisé pour transférer l'embryon de l'oeuf. Retirer délicatement la membrane vitelline avec # 5 forceps. Recueillir les embryons de caille autres que ci-dessus, et les mettre en scène sous un microscope à dissection.

3. Préparer l'embryon d'accueil pour recevoir la greffe

1. Retirer parafilm partir de l'hôte (poussin) embryon et en utilisant une aiguille de tungstène affûtée ou # 5 forceps, déchirer un petit trou dans la membrane vitelline à la région désirée du tube neural (figure 3A).
2. Ajouter une goutte de solution de Ringer à l'embryon. Prenez soin de garder l'embryon complètement immergé dans la solution de Ringer pendant toute la procédure pour prévenir la déshydratation des tissus. Continuer à ajouter des gouttes de la solution de Ringer à la surface de l'embryon par l'intermédiaire d'une pipette de transfert, si nécessaire.
3. En utilisant une aiguille de verre tiré, soigneusement faire rostral et caUdal incisions transversales correspondant à la longueur et la région d'intérêt dans le tube neural dorsal. (Aiguilles de verre Entraînées sont générés à partir des tubes de verre de silicium capillaires qui ont été tirés à la chaleur avec une aiguille de traction appareil.) Pour des greffes unilatérales les incisions ne devraient s'étendre à la lumière du tube neural dorsal, et pour des greffes bilatérales, faire des incisions dans l'ensemble du tube neural dorsal. Ensuite, couper bilatéral entre le tube neural dorsal et le mésoderme paraxial.
4. Soin séparer l'explant excisé du tube neural puis l'enlever de l'embryon par aspiration dans une micropipette de verre (figure 3B).

4. Préparer le tissu greffon du donneur

1. Choisissez une étape appariés embryon de caille. Maintenez l'embryon vers le bas avec une pince AA, retirez la membrane vitelline, et de l'accise une région de taille similaire du tube neural, comme décrit ci-dessus (3.3 à 3.4) (Figure 3A'-B '). Selon les besoins de votre expérience, cette région peut être unrégion complémentaire de l'hôte (poussin) du tube neural ou d'une autre région le long de l'axe rostro-caudal. (NB: pour les grandes greffes régionaux, y compris les greffes complètes du tube neural, les chercheurs pourraient vouloir ajouter une digestion par les protéases à cette étape pour supprimer tous les tissus adhérents mésenchymateuse du tissu du donneur avant la transplantation Toutefois, pour les petites dorsales greffes du tube neural à un stade précoce. , comme cela est détaillé ici, la digestion de protéase n'est pas nécessaire que le tube neural se sépare facilement de mésenchyme adjacent par des techniques chirurgicales strictement.)

5. Greffe du tissu

1. Aspirer l'explant donneur dans une micropipette de verre contenant une solution de Ringer. Veillez à ne pas introduire de bulles dans la pipette.
2. Transférer l'explant adjacente à la région excisé de l'hôte de poulet. Avec une aiguille de verre tiré, d'orienter l'explant et guidez dans la région ayant subi une ablation (figure 3C).
3. Ajouter avec précaution quelques gouttes de solution de Ringerà l'embryon à empêcher la déshydratation. Prenez soin de ne pas laisser tomber le liquide directement sur le site de la greffe, car cela pourrait déloger le greffon.
4. Sceller la fenêtre avec du ruban d'emballage. Assurez-vous que la bande des joints toute la région de l'œuf fenêtré. Cela empêche la déshydratation et la contamination de l'embryon pendant l'incubation ultérieure.
5. Retour de l'œuf dans l'incubateur jusqu'à ce que le stade de croissance désiré. Assurez-vous que la "bascule" la fonction est coupée alors que l'incubation des chimères. Les oeufs peuvent être légèrement tourné à la main deux fois par jour car cela peut augmenter leur viabilité si les stades ultérieurs du développement sont ciblés.

6. Préparer embryons chimériques pour la coupe

1. Au point limite expérimental, coupé le ruban couvrant la fenêtre à l'aide de ciseaux fins.
2. Saisissez le bord du blastoderme avec courbe iris pince (plus facile à faire avec mors striés), puis couper l'embryon loin de le jaune avec 4 grosses coupes en dehors des limites du blastoderme.
Transfert de l'embryon à une boîte de Pétri contenant une solution de Ringer. Prenez soin de minimiser l'exposition de l'embryon à l'air afin d'éviter la déshydratation des tissus.
3. En vertu de la stéréomicroscopie, séparer délicatement la membrane vitelline de l'aide blastoderme n ° 5 forceps.
4. Disposez soigneusement l'embryon dans le plat pour que l'embryon se trouve dans la même orientation que c'était dans l'œuf, avec des membranes entourant prévues à plat.
5. Utilisation de dissection aiguilles à base de tungstène fils ⁶⁴ à enlever proprement du blastoderme entourant de l'embryon en agençant l'aiguille à la limite de l'embryon et des tissus extraembryonnaires, avec la longueur de la parallèle à un fil de tungstène du fond de la boîte. Utilisez un mouvement de scie douce pour couper à travers les tissus.
6. Retirez soigneusement l'amnios avec # 5 forceps. À ce stade, vous pouvez, souhaitent soit de disséquer la région de votre intérêt, ou de laisser l'ensemble embryon.
7. Transfert de l'embryon à la glace paraffine 4% à froidormaldehyde et le rock toute la nuit à 4 ° C.
8. Préparer les échantillons et d'intégrer pour la coupe cryo-ou de la paraffine.

Tracez le tissu greffé au sein de l'embryon hôte. Il existe plusieurs techniques pour identifier un tissu de caille dans un embryon de poulet, y compris la détection de caille nucléoles par coloration hématoxyline (noyaux de caille ont de très grandes, les inclusions de coloration plus foncée que les noyaux de poulet), la réaction de Feulgen-Rossenbeck, acridine-orange ou biz-benzamide tache combinée avec la microscopie électronique, ou immunomarquage pour les cailles des antigènes spécifiques de ^3,47,65,66. Ici, nous utilisons l'antigène QCPN et standard tout-montage ou de l'article des techniques d'immunofluorescence pour identifier les cellules de la crête neurale de caille chez la caille-chick chimères (Figure 4). Cette technique permet plus de souplesse dans la conception expérimentale, comme l'immunofluorescence QCPN peuvent également être combinées avec d'autres anticorps pour identifier les cellules différenciées issues du donneur (la caille) des tissus. Utilisez standae toute-mount ou des techniques d'immunofluorescence section d'étiqueter caille des cellules dérivées de chimères.

7. Les résultats représentatifs

Une image représentative de la région greffée du tube neural, après 6h de ré-incubation (à HH11) montre l'incorporation devrait du donneur (la caille) tissu greffé dans l'hôte (poussin) du tube neural (figure 4A). Les embryons présentant l'intégration incomplète de la greffe, ou le développement asymétrique de la région crânienne ou somites après Réincubation doit être jeté.

Coupe transversale à travers la région greffée à HH11 CNC montrent marqués par HNK-1 migration latéralement loin du tube neural. Cellules de caille qui contribuent à la CCN flux migratoire, et le tube neural, sont clairement étiquetés avec QCPN (figure 4B).

Aux stades ultérieurs, les cailles de la CCN des cellules dérivées peuvent être attribués à leur tissu cible finale. Cellules QCPN étiquetés sont entrecoupées dans le mésenchyme embryon de pouletdu processus maxillaire à E5 (figure 4C).

L'anticorps QCPN peuvent être facilement combinés avec d'autres anticorps pour examiner la différenciation des cailles dérivés CNC dans l'environnement hôte. Caille CCN dérivés du trijumeau neurones sensoriels sont étiquetés par QCPN et Tuj1 anticorps (figure 4D).

Figure 1. Vue d'ensemble de la procédure expérimentale et les instruments nécessaires. Un hôte) (poussin) et bailleurs de fonds (la caille) embryons devrait être assorti stade. Pour marquer le flux de la CCN qui contribue à la ganglion de Gasser et maxillo-mandibulaire région, HH9 est idéal. Au HH9, le tube neural commence à se combler dans la région rostrale, mais n'est pas encore complètement scellé. La ligne grise dans les diagrammes représente la ligne médiane du tube neural de clôture. Les lignes pointillées blanches indiquent les lignes de coupe pour exciser une région du mésencéphale du côté droit du tube neural de l'hôte et du donneur embryos. La région de l'embryon excisé hôte est éliminé et le tissu du donneur transplantés pour générer l'embryon chimérique. B) les instruments nécessaires comprennent: une seringue) 5 ml avec 18 ½ aiguille hypodermique G, b) seringue de 1 ml à 26 ½ plié G aiguille hypodermique à angle de 45 °, c) l'encre de Chine, d) du ruban adhésif d'emballage, e) pipette en verre avec la bouche de pipetage appareil, f) 60 mm-boîte de Pétri, g) AA forceps, h) courbes pince iris avec mors striés, i) # 5 forceps, j) ciseaux fins, k) aiguisé fil de tungstène, l) tiré aiguille de verre, m) parafilm carrés.

Figure 2. Préparation des œufs et des embryons. A) transversale schéma de l'oeuf, y compris le point d'insertion idéal de 18 ½ aiguille hypodermique G pour le retrait de la lumière albumine. B) Après le retrait de l'albumine 3mL ~ la lumière, le jaune et l'embryon dans l'œuf diminue, permettant aux chercheurs de couper une «fenêtre» (flèches) en til coquille d'accéder à l'embryon. L'encre de Chine, 1:10 dilué dans une solution Ringer stérile, peut alors être injecté sous la blastoderme pour offrir un contraste pour la mise en scène facile des embryons. Embryon de poulet C) après encrage.

Figure 3. Schéma et des exemples de HH embryons au stade de donateurs et d'accueil 9 à chaque étape de la procédure de greffe. Un embryon), l'hôte de poussin. Les lignes pointillées dans le diagramme indiquent où la membrane vitelline devrait être déchirée pour accéder à la région crânienne pour le greffage. Une fois déchiré le lambeau triangulaire de la membrane vitelline doivent être pelés caudale. Boîte à image indique encart utilisé dans (Colombie-Britannique). A ') embryon donneur Quail. L'image est d'un embryon donneur excisé de l'œuf et mis en boîte de Pétri pour la dissection du tissu greffé. Boîte à image indique encart utilisé dans (B '). Les lignes pointillées dans le diagramme schématique (A ') indiquent où la vitelline et les membranes vitellines doivent être coupés afin d'éliminer til embryon à partir de l'œuf. Embryon hôte B) avec la région du mésencéphale unilatérale du tube neural excisée (flèches blanches) en attente de greffe. La ligne en pointillé dans le schéma indique où les coupes devraient être faites à l'accise du tube neural dans la région du mésencéphale. Embryon B 'des donateurs) avec tube de tissu greffé dorsale neurones excisée (greffe de tissu indiqué par des flèches noires). La ligne en pointillé dans le schéma indique où les coupes devraient être faites dans l'embryon de caille aux tissus du donneur d'accise pour la greffe unilatérale de la région du mésencéphale du tube neural. C) l'embryon chimérique après la greffe de caille explant tube neural dorsal dans la région du mésencéphale poussin.

Figure 4. Immunofluorescence détecter cailles spécifique QCPN antigène nucléaire dans les pays donateurs des cellules dérivées de l'embryon chimérique. A) Le total des montage image de HH11 chimère (greffé à HH9) montrant une coloration QCPN en rouge, et HNK-1 coloration (un marqueur de migration CCN) dansverte. Un grossissement de 10X, vue dorsale. B) Coupe transversale embryon dans (A), montrant des cellules de caille QCPN-positifs obtenus dans le tube neural et migrateurs CCN co-colorées avec HNK-1 (vert). Grossissement 40X. C) de la Croix-section à travers le processus maxillaire de chimère E5 (incubées pendant 3 jours après greffe), montrant QCPN-positifs CCN des cellules dérivées de (rouge) qui ont migré de la région greffée du tube neural à leur emplacement définitif dans l'embryon. Un grossissement de 10X. D) L'article à E5 contribution montrant chimère de cailles dérivée de la CCN à l'ganglion de Gasser (rouge) et la différenciation des neurones positifs TuJ1 (vert). Grossissement 40X. *, CNC; MP, processus maxillaire; NT, du tube neural; TG, ganglion de Gasser.

Discussion

Le greffage du tube neural de caille dans des embryons de poulet d'accueil décrit ici est une technique simple et peu coûteuse pour le traçage des sous-populations spécifiques de la migration CCN émanant de différentes régions le long de l'axe rostro-caudal ^21,67-69. Cette technique tire avantage de la facilité d'accès aux embryons d'oiseaux (par rapport aux embryons de mammifères) et peuvent être combinés avec d'autres techniques, telles que l'ablation des tissus, l'injection de m...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif	Entreprise	Le numéro de catalogue
Le poussin oeufs	Divers - nous utilisons la Texas A & M University Poultry Science Department, TX.
Les oeufs de caille	Divers - nous utilisons Société Egg Ozarks, MO.
Egg incubateur (affichage numérique 1502 Sportsman Incubateur w / Humidité alternatif de 110-120 volts)	www.poultrysupply.com	1502
Dumont AA forceps, Inox revêtement époxy	Outils belle science	11210-10
Ruban adhésif	N'importe quel magasin de fournitures de bureau
Courbé Iris pince	Outils belle science	11065-07
Jende d'encre	Tout magasin de fournitures artistiques
Pen / Strep (pénicilline, streptomycine) Solution	VWR International	101447-068
Clair ruban d'emballage	N'importe quel magasin de fournitures de bureau
Aiguille appareil de traction	Narashige, le Japon	PE-21
Aiguille de verre tiré, fait de 1,5 à 1,8 x tube de verre de borosilicate 100mm capillaire	Kimble Chase	34500 99
Tiré de verre pipette, fabriqué à partir de 5 ¾ "pipette Pasteur	Fisher Scientific	13-678-6A
Bouche pipette appareil (tube aspirateur pour pipettes microcapillaire calibré)	Sigma-Aldrich	A5177-52A
Dumont # 5 forceps	Outils belle science	11251-30
Tonneaufil gsten, diamètre 0,1 mm	VWR International	AA10404-H2
Porte-aiguilles (support de broche nickelé)	Outils belle science	26018-17
QCPN antisérum	Des études de développement de la Banque d'hybridome, Université de l'Iowa	QCPN
Alexa Fluor anticorps secondaire (par exemple, Alexa Fluor 594 chèvre anti-souris IgG1)	Invitrogen	A21125
Une solution de Ringer (2L): 14,4 g de NaCl 0,34 g de CaCl 2 0.74g KCl 0.230g Na 2 HPO 4 0,04 g de KH 2 PO 4 ddH 2 O à 2L Filtre à l'autoclave	Tous les réactifs de Fisher Scientific	7647-14-5 10043-52-4 7447-40-7 7558-79-4 7778-77-0