Assemblage in vitro de la semi-artificielle machine moléculaire et son utilisation pour la détection de lésions de l'ADN

Résumé

Nous démontrons l'assemblage et l'application d'un dispositif à l'échelle moléculaire alimenté par une protéine topoisomérase. La construction est un capteur bio-moléculaires dont les étiquettes deux grands types de cassures de l'ADN dans les coupes de tissus en attachant deux fluorophores différents à leurs extrémités.

Résumé

Naturelle bio-moléculaire des machines de travail dans chaque cellule vivante et d'afficher une variété de modèles ^1-6. Pourtant, le développement de centres de machines moléculaires artificielles sur des appareils capables de mouvement directionnel, c'est à dire les moteurs moléculaires, et sur ​​leur échelle réduite des pièces mécaniques (roues, essieux, etc pendentifs) ^7-9. Cette imite les machines macro-, même si les propriétés physiques essentielles pour ces appareils, tels que l'inertie et la conservation du moment, ne sont pas utilisables dans les environnements nanomonde ^10. Conceptions alternatives, qui ne suivent pas les schémas mécaniques macromachines et utiliser des mécanismes développés dans l'évolution des molécules biologiques, peuvent profiter des conditions spécifiques du nanomonde. Par ailleurs, l'adaptation réelle des molécules biologiques aux fins de la nano-conception permet de réduire les dangers potentiels des produits des nanotechnologies peuvent présenter. Ici nous démontrons l'assemblage et l'application d'une telle bio-permis de construire, commeemi-artificiel appareil moléculaire, qui associe une machine naturelle moléculaire avec des composants artificiels. Du point de vue de l'enzymologie, notre construction est un concepteur fluorescents complexes enzyme-substrat mis ensemble pour remplir une fonction spécifique utile. Cet ensemble est par définition une machine moléculaire, car il contient un ^12. Pourtant, son intégration avec la partie ingénierie - fluorescentes épingle double - le re-dirige vers une nouvelle tâche d'étiquetage ¹² dommages à l'ADN.

Notre construire assemble d'un ADN de 32-mer et d'une enzyme topoisomérase I vaccine (VACC TOPO). La machine utilise alors son propre matériel pour fabriquer deux unités de détection marqués par fluorescence (figure 1). L'une des unités (fluorescence verte) effectue VACC TOPO covalente à son extrémité 3 'et une autre unité (fluorescence rouge) est une épingle à cheveux libres avec un 3'OH terminal. Les unités sont de courte durée et rapidement montés de nouveau dans la construction d'origine, qui recleaves ultérieurement.En l'absence d'ADN pauses ces deux unités séparées en continu et religate de façon cyclique. Dans des coupes de tissus avec des dommages à l'ADN, l'unité de détecteur de topoisomérase porteurs attache sélective aux cassures de l'ADN à bouts francs avec 5'OH (DNase II de type casse) ^11,12, fluorescence leur étiquetage. La seconde, sans enzyme épingle formé après clivage oligonucléotidique, sera ligaturer à un 5'PO ₄ à extrémité franche rupture (DNase I type pauses) ^11,12, si l'ADN ligase T4 est présent dans la solution ^13,14. Lorsque l'ADN ligase T4 est ajouté à une coupe de tissu ou d'une solution contenant de l'ADN avec des 5'PO ₄ bouts francs pauses, la ligase réagit avec 5'PO ₄ extrémités d'ADN, formant semi-stable enzyme-ADN. Les épingles à bouts francs vont interagir avec ces complexes libérant épingles ligase et lier de façon covalente à l'ADN, ce qui étiquetage 5'PO ₄ cassures de l'ADN à bouts francs.

Ce développement illustre une nouvelle approche pratique pour ela conception électronique de machines moléculaires et offre un capteur utile pour la détection de l'apoptose et endommagent l'ADN dans les cellules et les tissus fixes.

Protocole

Les sections de la machine moléculaire basé sur la détection devrait être préparée d'abord parce que leur préparation prend plus de temps que le montage du dispositif moléculaire. La construction fonctionne bien avec le 5-6 microns d'épaisseur pans coupés du paraformaldéhyde-fixes, des blocs de tissus inclus en paraffine. Utiliser les marques diapositives qui conservent des sections bien, comme ProbeOn plus diapositives chargées et préalablement nettoyées (Fisher Scientific) ou similaire. Nous recommandons d'abord en utilisant un tissu avec un motif bien connu de dommages à l'ADN, qui contient à la fois la DNase I et II DNase de type casse, comme la dexaméthasone-rat traité apoptotiques thymus ^13,14.

1. Préparation des sections

1. Placer les coupes dans un rack de diapositives et déparaffinage au xylène pendant 15 min, le transfert à un bain de xylène frais pour 5 minutes supplémentaires.
2. Réhydrater en passant par la concentration d'éthanol à 96% d'éthanol-2x5min; 80% d'éthanol - 5min; eau - 2x5 min.
3. Recueil section avec Proteinase K. Utiliser 100 pi d'une solution 50μg/mL par section. Incuber 15 'à température ambiante (23 ° C) dans une chambre humidifiée. Le temps peut nécessiter un ajustement en fonction du type de tissu. Tissus durs pourrait exiger plus de digestion. Les temps de 15-25 minutes sont généralement utilisés. La digestion insuffisant peut entraîner l'affaiblissement du signal. Overdigestion sur les résultats d'autre part dans la disparition du signal et des perturbations article.
4. Rincer à l'eau distillée pour min 2x10.
5. Appliquer 100 ul par la section de BSA 2% pour preblocking. Incuber pendant 15 min à température ambiante (23 ° C). Pendant ce temps assemblage de la machine moléculaire.

2. Moléculaire de montage des machines

Tous les réactifs sont mis à l'échelle de 25 uL volume total, ce qui est suffisant pour une détection unique dans une coupe de tissu de taille moyenne (10x10mm). Le volume peut être adapté selon les besoins.

1. Mélanger dans une petit tube en plastique dans cet ordre:

Eau bidistillée; Glycol, le polyéthylène-8000 15%; Solution de 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, MgCl2 5 mM, 0,1 mM dithioérythritol, ATP 1 mM, (c'est à dire régulièrement tampon T4 DNA ligase); 70 pmoles de l'oligonucléotide 1, 215 pmoles (1,76 à 7,1 mg) VACC TOPO 10 unités de T4 ADN ligase (500 U / ml)

2. Mélanger doucement par pipetage. Le moléculaires de construire presque instantanément s'auto-assemble dans cette solution et peut être utilisé immédiatement à la température ambiante (23 ° C). Augmenter la température à 37 ° C bloque la T4 ADN ligase composante fondée sur l'étiquetage.

3. L'utilisation de machines moléculaires dans des coupes de tissus au 5'OH étiquette double et 5'PO4 cassures de l'ADN

1. Aspirer la solution preblocking et appliquer 25 pi du mélange de réaction complète contenant 70 pmoles de l'oligonucléotide 1, 53 à 215 pmoles (1,76 à 7,1 mg) VACCTOPO et 10 unités de T4 ADN ligase (500 U / ml) dans une solution de 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM _de MgCl2, 0,1 mM dithioérythritol, ATP 1 mM, et de polyéthylène glycol de 15%-8000. L'oligonucléotide même séquence portant un label unique FITC, oligonucléotide 2, peut être utilisé à la place pour la détection d'un seul type de cassures de l'ADN. Dans ce cas omettre ligase de la réaction de marquage. Aussi, dans cette situation une solution de 50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 15% de PEG-8000 peut être utilisé à la place de tampon ADN ligase T4.
2. Incuber pendant 1 heure à température ambiante (23 ° C) dans une chambre humidifiée avec une lamelle de plastique. Protéger de la lumière. Abaissement de la température à 16 ° C réduit le signal de ligase-fondée; l'augmentation de la température à 37 ° C élimine complètement le signal ligase basé. Une inhibition partielle de la ligase survient parfois dans le mélange réactionnel, possiblement en raison de contaminants introduits avec des préparations topoisomérase. Par conséquent, incubation plus longue (2-4 heures) pourrait être nécessaire en particulier lorsque sRINCIPALES numéros de ligase marqué des pauses sont présents. Bien que les deux signaux ligase et topo peut être observée à ce stade, dans de nombreux cas le signal ligase peut être renforcée par une nouvelle application du mélange réactionnel sans VACC TOPO et double-oligonucléotide marqué, mais contenant un oligonucléotide en épingle à cheveux en forme (oligonucléotide 3) (35 mg / mL) et l'ADN ligase T4 (250 U / ml). Pour améliorer le signal passer à l'étape 3, pour voir la réaction sans amélioration passez à l'étape 5.
3. Retirez délicatement par des lamelles immergeant la coulisse verticalement dans une jarre de Coplin contenant de l'eau à température ambiante. Aspirer l'excès d'eau.
4. Améliorer le signal ligase en appliquant 25 uL du mélange réactionnel sans VACC TOPO et l'oligonucléotide 1, mais contenant l'oligonucléotide 3: 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, MgCl2 5 _mM, 0,1 mM dithioérythritol, ATP 1 mM, et de polyéthylène glycol de 15% 8000, 5 unités de T4 ADN ligase, 35 mg / ml Oligonucleotide 3 (en épingle à cheveux à bouts francs). Le volume total de la solution d'étiquetage can être élargi pour accueillir les sections plus grandes. Incuber pendant 18 heures (une nuit) à la température ambiante (23 ° C) dans une chambre humidifiée avec une lamelle de plastique.
5. Retirez délicatement par des lamelles immergeant la coulisse verticalement dans un bocal contenant de l'eau Coplin à température ambiante. Puis, lavez la section 3x10 min dans de l'eau distillée.
6. Rincer avec un tampon de bicarbonate de sodium. Solution alcaline rincez améliore fluorescence FITC, qui est sensible au pH et est considérablement réduite en dessous de pH 7.
7. Couvrir la section avec une solution antidécoloration (Vectashield avec DAPI), la lamelle et d'analyser le signal en utilisant un microscope à fluorescence. Cassures de l'ADN double-brin avec une fluorescence verte 5'OH, 5'PO ₄ pauses - une fluorescence rouge (figure 2).

4. Les résultats représentatifs

Figure 1. Semi-artificielle machine moléculaire détecte deux types deDommages à l'ADN in situ. La machine fluorescente s'auto-assemble en VACC TOPO se lie à l'épingle double-32-Mer. La machine commence à fonctionner en se divisant en deux unités de détection par la topo-isomérase fait coupé à l'extrémité 3 'de la séquence de reconnaissance. Il en résulte un processus cyclique où l'unité marquée au FITC sépare en continu et religates revenir à la marqué à la rhodamine unité. Cette persiste jusqu'à une cassure de l'ADN détectable est rencontré. Quand un tel accepteurs alternatifs (5'OH pause émoussé l'ADN de fin) est présent dans la section de tissu, la partie sera FITC ligaturer à elle. La partie restante sera la rhodamine attacher à 5 'PO ₄ cassures de l'ADN extrémité émoussée avec l'aide de l'ADN ligase T4. En conséquence, deux types de cassures de l'ADN sont détectés simultanément.

Figure 2. Étiquettes machine moléculaire double de deux types de cassures de l'ADNdans une section de tissu de dexaméthasone-traitée thymus. Cassures de l'ADN à extrémité franche de DNase I et de type DNase II sont détectés dans les zones corticales thymiques en apoptose. Vert fluorescence cytoplasmique (5'OH cassures de l'ADN) des marques macrophages corticale digérer des matières nucléaires de thymocytes apoptotiques. Ce signal est produit par VACC TOPO, et se localise dans phagolysosomes avec de l'ADN contenant 5'OH cassures double brin ^11,12. Fluorescence rouge (5'PO ₄ pauses) des noyaux de thymocytes apoptotiques étiquettes n'est pas englouti par les macrophages. Un très grand nombre de thymocytes simultanément apoptose accompagné génération de 5'PO ₄ cassures double brin, visualisés par ligase étiquetage basé. Ces pauses sont situés à la périphérie du noyau, formant motifs en forme d'anneau. Tous les noyaux cellulaires sont visualisés par une contre-coloration au DAPI (fluorescence bleue).

Discussion

Dans cette vidéo, nous démontrons comment assembler et à utiliser un capteur à double marquage de l'ADN des dommages. Le capteur est une machine moléculaire tirée par la bio-moléculaires moteur, un virus protéine codée VACC TOPO liés à des composants artificiels. Le développement a présenté illustre une approche bio-permis qui prône l'adaptation des structures biologiques, des architectures et des pièces réelles et des composants de cellules à la conception des dispositifs de non-toxique à l'échelle molécula...

Matériaux