Cette méthode décrit un rendement élevé in vitro synthèse d'ARNm capés et non capés à partir d'un plasmide linéarisé contenant le Gaussia gène de la luciférase (GLuc). L'ARN est purifié et une fraction de l'ARN non capée est capée enzymatiquement à l'aide du Vaccinia enzyme de coiffage viral. Dans la dernière étape, l'ARNm est transfecté dans des cellules HeLa et les surnageants de culture cellulaire sont analysés pour l'activité de la luciférase.
Article de méthode
Transcription in vitro et plafonnement de l'ARNm de luciférase Gaussia Suivie par la transfection de cellules HeLa
Dans cet article
Résumé
Résumé
La transcription in vitro correspond à la synthèse de transcrits d'ARN par une ARN polymérase à partir d'un modèle d'ADN linéaire contenant la séquence du promoteur correspondant (T7, T3, SP6) et le gène à transcrire (Figure 1A). Une réaction de transcription typique comprend l'ADN matrice, l'ARN polymérase, les ribonucléotides triphosphates, un inhibiteur de RNase et un tampon contenant des ions Mg2+.
De grandes quantités d'ARN de haute qualité sont souvent nécessaires pour diverses applications. L'utilisation de la transcription in vitro a été rapportée pour des études sur la structure et la fonction des ARN, telles que l'épissage1, des expériences d'ARNi dans des cellules de mammifères2, l'amplification d'ARN antisens par la « méthode d'Eberwine »3, l'analyse par puces à ADN4, ainsi que pour des études sur les vaccins à ARN5. Cette technique peut également être utilisée pour produire des sondes radiomarquées ou marquées par colorant6. Warren et al. ont récemment rapporté le reprogrammation de cellules humaines par transfection avec un ARN coiffé transcrit in vitro7. Le kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 de New England Biolabs a été conçu pour synthétiser jusqu'à 180 μg d'ARN par réaction de 20 μl. Des ARN d'une longueur allant jusqu'à 10 kb ont été transcrits avec succès à l'aide de ce kit. L'ADN plasmidique linéarisé, les produits de PCR et les oligonucléotides d'ADN synthétiques peuvent être utilisés comme matrices pour la transcription, à condition qu'ils contiennent la séquence promoteur T7 en amont du gène à transcrire.
L'ajout d'une structure de coiffe en position 5' sur l'ARN est un processus important chez les eucaryotes. Il est essentiel pour la stabilité de l'ARN8, la traduction efficace9, le transport nucléaire10 et l'épissage11. Ce processus implique l'ajout d'une coiffe de 7-méthylguanosine à l'extrémité triphosphate 5' de l'ARN. La coiffage de l'ARN peut être réalisé post-transcriptionnellement à l'aide d'enzymes de coiffage ou co-transcriptionnellement à l'aide d'analogues de coiffe. Dans la méthode enzymatique, l'ARNm est coiffé à l'aide de l'enzyme de coiffage du virus de la Vaccinia12,13. Cette enzyme ajoute une coiffe de 7-méthylguanosine à l'extrémité 5' de l'ARN en utilisant le GTP et la S-adénosylméthionine comme donneurs (structure cap 0). Les deux méthodes produisent un ARN coiffé fonctionnellement actif, adapté à la transfection ou à d'autres applications14, telles que la génération d'ARN génomique viral pour des systèmes de génétique inverse15 et des études cristallographiques de protéines liant la coiffe, comme l'eIF4E16.
Dans la méthode décrite ci-dessous, le kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 de NEB est utilisé pour synthétiser des ARN messagers capés et non capés de la luciférase de Gaussia (GLuc) et de la luciférase de Cypridina (CLuc). Une partie de l'ARN GLuc non capé est cappée à l'aide du système de capage vaccinia (NEB). Un plasmide linéarisé contenant le gène GLuc ou CLuc et un promoteur T7 sert d'ADN matrice. L'ARN transcrit est transfecté dans des cellules HeLa et les surnageants de culture cellulaire sont analysés pour mesurer l'activité luciférase. L'ARN CLuc cappé est utilisé comme témoin interne pour normaliser l'expression de GLuc.
Protocole
Les RNases sont couramment présentes sur la peau, les cheveux, la poussière, les surfaces de laboratoire, les solutions, etc. Portez des gants et nettoyez soigneusement la surface de la paillasse, les pipettes, etc. avant utilisation afin d'éviter toute contamination par les RNases. L'utilisation de pointes de pipette, de tubes, de matériel en verre et de réactifs exempts de nucléases est fortement recommandée.
1. Transcription in vitro à l'aide du kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7
Le modèle d'ADN pour la réaction de transcription est un plasmide linéarisé contenant le gène de la luciférase de Gaussia et un promoteur T7 en amont de la séquence codante (Figure 1B).
- Dégeler les composants du kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 et les maintenir sur de la glace.
- Pour l'ARN non capé, préparer la réaction à température ambiante dans l'ordre suivant :
| Composant | Volume (μl) | Final |
| Eau sans nucléase* | X | |
| Tampon de réaction 10X | 2 | 1X |
| ATP (100 mM) | 2 | 10mM |
| CTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| UTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| GTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| ADN matrice * | X | 1 μg |
| Mélange de polymérase ARN T7 | 2 | |
| Total | 20 |
*Ajouter 1 μg d'ADN et compléter le volume total de la réaction à 20 μl avec de l'eau sans nucléase. La quantité d'eau à ajouter variera en fonction de la concentration de l'ADN matrice.
- Pour l'ARN coiffé : Préparer la réaction à température ambiante dans l'ordre suivant :
| Composant | Volume (μl) | Final |
| Eau sans nucléase* | X | |
| Tampon de réaction 10X | 2 | 1X |
| ATP (100 mM) | 2 | 10 mM |
| CTP (100 mM) | 2 | 10 mM |
| UTP (100 mM) | 2 | 10 mM |
| GTP (20 mM) | 2 | 2 mM |
| Analogon de capuche 3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G (ARCA) (40 mM) | 4 | 8 mM |
| ADN matrice* | X | 1 μg |
| Mélange de polymérase ARN T7 | 2 | |
| Total | 20 |
*Ajouter 1 μg d'ADN et compléter le volume réactionnel total à 20 μl avec de l'eau sans nucléase. La quantité d'eau à ajouter variera en fonction de la concentration de l'ADN matrice.
- Mélanger soigneusement par vortexage et incuber les réactions à 37 °C pendant 2 heures dans un incubateur à air sec.
- En suivant les étapes 1.3 à 1.4, synthétiser des transcrits coiffés de la luciférase de Cypridina (CLuc) à partir d’un plasmide linéarisé contenant le gène CLuc. Cet ARNm sera co-transfecté avec l’ARNm GLuc coiffé et non coiffé afin de normaliser l’expression de GLuc.
2. Élimination de l'ADN matrice
Les réactions de transcription sont traitées avec la DNase I pour éliminer le modèle d'ADN avant de procéder à la purification.
- Ajouter 70 μl d'eau sans nucléase aux réactions de transcription, suivis de 10 μl de tampon de réaction de l'ADNase I.
- Ajouter 2 μl d'ADNase I aux réactions.
- Incuber à 37 °C pendant 15 minutes dans un incubateur à air sec.
3. Purification par colonne de l'ARN capé et non capé
- Purifiez l'ARN capé et non capé à l'aide du MEGAclearKit, conformément aux instructions du fabricant (tout kit de purification d'ARN basé sur des colonnes centrifugeables peut être utilisé).
- Quantifiez l'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop.
- Évaluez la qualité de l'échantillon d'ARN conformément aux instructions du fabricant, en utilisant le kit Agilent RNA 6000 Nano et l'analyseur bioanalytique Agilent 2100.
4. Capping d'ARN à l'aide du système de capping Vaccinia
- Prendre 10 μg d'ARNm GLuc purifié non coiffé.
Une réaction d'emboutissage standard peut caper jusqu'à 10 μg d'ARN (100 nu ou plus). Si une quantité plus importante d'ARN doit être capée, la réaction peut être augmentée en conséquence.
- Porter le volume à 15 μl à l’aide d’eau sans nucléase.
- Chauffer l’ARN à 65 °C pendant 10 minutes afin d’éliminer les structures secondaires. Placer sur de la glace pendant 5 minutes.
- Pour préparer la réaction de coiffage, ajouter 2 μl de tampon de coiffage 10X, 1 μl de GTP (10 mM), 1 μl de S-adénosylméthionine fraîchement diluée (2 mM) et 1 μl (10 unités) d’enzyme de coiffage vaccinique au 15 μl d’ARN dénaturé.
- Mélanger soigneusement par vortexage doux et incuber la réaction à 37 °C pendant 30 minutes dans un incubateur à air sec.
5. Purification par colonne de l'ARN coiffé
- Purifiez l'ARN coiffé à l'aide du kit MEGAclear (tout kit de purification d'ARN basé sur des colonnes de centrifugation peut être utilisé).
- Suivant les instructions du fabricant, évaluez la qualité de l'échantillon d'ARN à l'aide du kit Agilent RNA 6000 Nano et de l'analyseur bioanalytique Agilent 2100.
6. Transfection de cellules HeLa à l'aide du kit de transfection TransIT mRNA
- Ensemencer des cellules HeLa dans une plaque de 48 puits contenant 150 μl de milieu de culture de Dulbecco (DMEM) à forte teneur en glucose, supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (0,7-2,3 × 105 cellules/puits).
- Incuber pendant 16 à 24 heures à 37 °C afin que les cellules atteignent une confluence de 60 à 90 %.
- Diluer les ARN GLuc (avec et sans capuchon) et CLuc à une concentration de 100 ng/μl.
Chaque transfection est effectuée en huit réplicats.
- Préparer 8 microtubes tubes. Ajouter à chaque tube 1 μl ARN GLuc non capé, 1 μl ARN CLuc capé (pour la normalisation) et 25 μl de DMEM sans sérum. Mélanger soigneusement.
- Préparer 8 tubes Eppendorf. Ajouter à chaque tube 1 μl ARN GLuc coiffé (analogon de capuche), 1 μl ARN CLuc capé (pour la normalisation) et 25 μl de DMEM sans sérum. Mélanger soigneusement.
- Préparer 8 tubes Eppendorf. Ajouter à chaque tube 1 μl ARN GLuc coiffé (Vaccinia), 1 μl ARN CLuc avec cap (pour la normalisation) et 25 μl de DMEM sans sérum. Mélanger soigneusement.
- Ajouter 0.2 μl Réactif de renforcement d'ARNm au premier ensemble de 8 tubes et mélanger.
- Ajouter 0.2 μl TransAjouter le réactif d'ARNm IT aux huit premiers tubes et mélanger.
- Incuber à température ambiante pendant 2 à 5 minutes. (Ne pas incuber plus de 5 minutes).
- Ajouter la mixture de transfection goutte à goutte dans les puits contenant les cultures de cellules HeLa (se référer Figure 3 pour la préparation de la plaque).
- Répétez les étapes 7 à 10 avec le 2nd et 3rd ensembles de 8 tubes
- Incuber toute la nuit (16 heures) à 37 °C dans 5 % de CO2.
7. Dosage de la luciférase de Gaussia (GLuc)
Dosage du surnageant de chaque puits pour l'activité GLuc à l'aide du kit de dosage de la luciférase Gaussia BioLux selon les étapes suivantes :
- Préparez une solution fraîche de dosage en ajoutant 15 μl de BioLux GLuc Substrate à 1,5 ml de BioLux GLuc Assay Buffer (50 μl de solution de dosage requis par échantillon). Préparez une quantité suffisante pour les échantillons et pour amorcer l'injecteur du luminomètre (reportez-vous aux instructions du fabricant).
- Mélangez soigneusement en retournant le tube plusieurs fois (ne pas vortexer).
La luminescence est mesurée à l'aide du luminomètre pour microplaque Centro LB 960 de Berthold Technologies.
- Régler le luminomètre sur un volume d'injection de 50 μl et une intégration de 2 à 10 secondes.
- Ajouter 10 μl du surnageant de culture cellulaire de chaque puits dans une plaque noire de 96 puits.
- Amorcer l'injecteur avec la solution d'essai et procéder à la mesure de la luminescence.
- Les valeurs obtenues à partir des puits non transfectés seront utilisées comme témoins négatifs.
8. Dosage de la luciférase de Cypridina (CLuc)
Dosage du surnageant de chaque puits pour l'activité CLuc à l'aide du kit de dosage de la luciférase Cypridina BioLux selon les étapes suivantes :
- Préparez le substrat fraîchement reconstitué (100x) conformément aux instructions fournies dans le manuel du kit.
- Décongelez le tampon de dosage de la luciférase BioLux Cypridina et mélangez soigneusement (protégez de la lumière).
- Pour préparer la solution de dosage CLuc, ajoutez 15 μl de substrat reconstitué (100x) à 1,5 ml de tampon de dosage de la luciférase BioLux Cypridina (50 μl de solution de dosage requis par échantillon). Préparez une quantité suffisante pour les échantillons et pour amorcer l'injecteur du luminomètre (reportez-vous aux instructions du fabricant).
- Mélangez soigneusement en retournant plusieurs fois le tube (ne pas vortexer).
- Gardez la solution à température ambiante pendant 30 minutes (protégez de la lumière).
La luminescence est mesurée à l'aide du luminomètre pour microplaques Centro LB 960 de Berthold Technologies.
- Régler le luminomètre sur une injection de 50 μl, un délai de 1 à 2 secondes et une intégration de 2 à 10 secondes.
- Ajouter 10 μl du surnageant de culture cellulaire de chaque puits dans une plaque noire de 96 puits.
- Amorcer l'injecteur avec la solution d'essai CLuc et mesurer la luminescence.
- Les valeurs obtenues à partir des puits non transfectés seront utilisées comme témoins négatifs.
9. Résultats représentatifs
Le kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 peut produire jusqu'à 180 μg d'ARN non coiffé et de 40 à 50 μg d'ARN coiffé par réaction de 20 μl. Lorsqu'on analyse l'ARN sur l'Agilent 2100 Bioanalyzer, un ARN de bonne qualité et intact doit présenter un pic unique et net correspondant au transcrit d'ARN. Un pic large ou plusieurs pics indiquent une dégradation de l'ARN. Il est également important de vérifier la taille de l'ARN. La présence de transcrits d'ARN plus longs que prévu peut être due à une digestion incomplète de l'ADN plasmidique matrice. La dégradation de l'ARN et un rendement plus faible sont généralement dus à des contaminants introduits dans la réaction à partir de l'ADN matrice. Figure 2 illustre un exemple d'électrophérogramme et d'image de gel obtenus après analyse d'un ARN de haute qualité et intact sur le Bioanalyzer.
La transfection de cellules HeLa avec des ARN GLuc capés et non capés est suivie d'une incubation et d'un dosage de l'activité luciférase dans les surnageants de culture cellulaire. La structure de coiffe en 5' est importante pour protéger l'ARN contre la dégradation par les exonucléases8 et pour favoriser l'initiation de la traduction de l'ARNm9. Par conséquent, la capylation de l'ARN constitue une étape essentielle pour les expériences de transfection. La méthode co-transcriptionnelle (analogue de coiffe) permet d'obtenir environ 40 μg d'ARN capés à 80 %. Le protocole utilisant l'enzyme de capylation vacciniale capyle jusqu'à 10 μg d'ARN (100 nucléotides ou plus) par réaction avec une efficacité quasi totale.
Figure 4 illustre la différence d'expression de la luciférase entre des cultures transfectées avec des échantillons d'ARN capés et non capés. On observe clairement que les cultures cellulaires transfectées avec de l'ARN capé présentent une expression de la luciférase nettement plus élevée par rapport à celles transfectées avec de l'ARN non capé (qui ne montrent aucune activité luciférase). De plus, Figure 4 confirme également que les deux techniques de capage, utilisant un analogue de capuchon ou l'enzyme de capage de la vaccine, produisent avec succès des transcrits d'ARN fonctionnels et capés pouvant être traduits en protéines. La valeur de p bilatérale obtenue à partir du test t était de 0,2583, ce qui indique qu'il n'existe aucune différence statistique significative entre les données de luminiscence des deux méthodes de capage.
Figure 1A. Synthèse d'ARN par la polymérase ARN T7
Figure 1B. Vecteur pCMV-GLuc contenant le gène GLuc et le promoteur T7.
Figure 2. Électrophérogrammes du Bioanalyzer et image en gel d'ARN coiffé et non coiffé. L'axe des abscisses représente la taille de l'ARN en nucléotides (nt) et l'axe des ordonnées indique les unités de fluorescence (FU). A) Électrophérogramme de l'ARNm GLuc (non coiffé) après purification. B) Électrophérogramme de l'ARNm GLuc (coiffé à l'aide de l'enzyme de coiffage de la Vaccinia). C) Électrophérogramme de l'ARNm GLuc (coiffé de manière co-transcriptionnelle à l'aide d'un analogue de coiffe). D) Image similaire à un gel générée par le Bioanalyzer. La voie « L » correspond à l'échelle d'ARN, la voie 1 à l'ARNm GLuc non coiffé, la voie 2 à l'ARNm GLuc coiffé à l'aide de l'analogue de coiffe et la voie 3 à l'ARN GLuc coiffé à l'aide de l'enzyme de coiffage de la Vaccinia.
Figure 3. Exemple de configuration de plaque pour la transfection de cellules HeLa. Chaque puits contient des cellules HeLa ensemencées ayant une confluence de 60 à 90 %. Le mélange de transfection, composé de l'ARN GLuc approprié (sans capuchon, avec capuchon ajouté à l'aide d'un analogue de capuchon ou avec l'enzyme de capuchonnage de la Vaccinia), de l'ARN CLuc capuchonné (pour la normalisation), du réactif mRNA Boost et du réactif TransIT mRNA, est ajouté dans chaque puits. Chaque transfection est réalisée en huit réplicats (puits de même couleur sur la figure).
Figure 4.Expression de GLuc dans des cellules HeLa. Des ARN messagers GLuc purifiés, capés et non capés, ont été transfectés dans des cellules HeLa et incubés toute une nuit (16 h) à 37 °C. Les surnageants de culture cellulaire provenant de chaque puits ont été analysés pour l'activité de GLuc et de CLuc, et les valeurs de luminiscence ont été enregistrées. Les valeurs de luminiscence de GLuc ont été normalisées par rapport aux valeurs de luminiscence de l'ARN CLuc capé.
* La luminescence des cellules non transfectées a été soustraite des valeurs de GLuc et de CLuc avant la normalisation.
Marques déposées
BioLux est une marque déposée de New England Biolabs, Inc.
TransIT est une marque déposée de Mirus Bio LLC.
MEGAclear est une marque déposée d'Ambion.
Discussion
In vitro, la transcription est une méthode utile pour obtenir de forts rendements d'ARN destinés à diverses applications. Le principal avantage de l'utilisation du kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 réside dans sa formulation optimisée pour produire de hauts rendements d'ARN. De plus, les réactifs fournis dans le kit sont exempts de nucléases contaminantes, ce qui permet d'obtenir des transcrits d'ARN de haute qualité et intacts. Le kit est conçu pour offrir une grande stabilité et une grande souplesse d'utilisation, permettant ainsi la synthèse d'ARN messagers, d'ARN marqués par des colorants, de sondes radiomarquées à haute activité spécifique et d'ARN capés. Le manuel du kit contient une liste de protocoles spécifiques ainsi que les matériaux supplémentaires nécessaires pour chacune de ces applications. Il inclut également des informations techniques sur l'utilisation de produits de PCR et d'oligonucléotides d'ADN synthétiques comme matrices pour la transcription. Il est important de noter que le kit de transcription ne peut utiliser que des matrices d'ADN contenant un promoteur T7.
La méthode décrite dans cet article démontre le capage post-transcriptionnel de l'ARN à l'aide de l'enzyme de capage du virus vaccinia, ainsi que le capage co-transcriptionnel à l'aide d'un analogue de la structure du cap de l'ARN. Nous avons montré que les deux méthodes produisent un ARN capé fonctionnellement actif après transfection. La structure du cap en 5' améliore la stabilité de l'ARN et l'efficacité de la traduction, et est donc importante pour les expériences de microinjection11 et de transfection7. La méthode de capage co-transcriptionnel permet d'obtenir 40 à 50 μg d'ARN capé à environ 80 %. Il est important de noter que l'utilisation de l'analogue de cap d'ARN 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA), bloqué au niveau du groupe hydroxyle en 3' du m7G, garantit l'incorporation du cap dans l'orientation correcte17. Pour caper des quantités plus importantes d'ARN, il est possible d'augmenter l'échelle des réactions standard pour les deux méthodes de capage. Toutefois, l'utilisation du système de capage vaccinia représenterait une option plus économique, car le capage co-transcriptionnel utilise un analogue de cap, composant relativement coûteux. Le système de capage vaccinia constitue également une meilleure méthode, car son efficacité de capage atteint presque 100 %.
Les méthodes de coiffage de l'ARN décrites ci-dessus synthétisent un ARN portant une structure de type cap 0 à l'extrémité 5'. La structure cap 1 implique une méthylation supplémentaire au niveau de la position 2'-O du sucre ribose du premier nucléotide à l'extrémité 5' de l'ARN. La structure cap 1 a été signalée comme améliorant l'efficacité de traduction de l'ARN18 et peut être intégrée en utilisant une 2'-O-méthyltransférase20, 21.
La méthode décrite dans cet article peut être utilisée pour transcrire, caper et transfecter tout ARNm souhaité. Les luciférases GLuc et CLuc ont été spécifiquement utilisées dans ce protocole en raison de leurs nombreux avantages. Elles sont directement sécrétées dans le milieu cellulaire, évitant ainsi la nécessité de lyser les cellules. De plus, elles produisent une intensité élevée de signal bioluminescent, et les dosages d'activité sont très sensibles et faciles à réaliser. Il est important de noter que l'expression de GLuc dans les cellules peut être influencée par divers facteurs autres que la fonctionnalité de l'ARN lui-même. Parmi ces facteurs, citons les erreurs de pipetage, le nombre variable de cellules par puits, l'efficacité de la transfection, etc. La normalisation des données permet de tenir compte de ces facteurs. Dans notre protocole, nous co-transfectons l'ARN CLuc comme témoin interne avec l'ARN GLuc. Lorsque la luminescence de GLuc est divisée par les valeurs du témoin CLuc, elle est normalisée par rapport aux erreurs et à la variabilité de la transfection19.
Déclarations de divulgation
Tous les auteurs sont employés de New England Biolabs, Inc.
Remerciements
Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 | New England Biolabs | E2040S | |
| Analogue de structure de coiffe ARN 3’-0-Me-m7G(5’)ppp(5’)G | New England Biolabs | S1411S | |
| DNase I (sans RNase) | New England Biolabs | M0303S | |
| Système de coiffage vaccinia | New England Biolabs | M2080S | |
| Kit MEGAclear | Ambion | AM1908 | |
| Spectrophotomètre NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Kit Agilent RNA 6000 Nano | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Kit de transfection d'ARNm TransIT | Mirus Bio LLC | MIR2250 | |
| Milieu liquide classique HyClone* : milieu de Dulbecco’s Modified Eagle’s, haute teneur en glucose | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30285.01 | |
| Acides aminés non essentiels HyClone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30238.01 | |
| Centro LB 960 | Berthold Technologies | ||
| Kit de dosage de la luciférase Gaussia BioLux | New England Biolabs | E3300S | |
| Kit de dosage de la luciférase Cypridina BioLux | New England Biolabs | E3309S | |
| Inhibiteur de RNase, murin | New England Biolabs | M0314 | |
| Inhibiteur de RNase, placenta humain | New England Biolabs | M0307 | |
| Plasmide témoin pCMV-GLuc | New England Biolabs | N8081 |
Références
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Réimpressions et autorisations
