Ici, nous démontrons notre protocole pour l'isolement de cellules basales et sous-muqueuse du canal de la glande trachées de souris. Nous démontrons également la méthode de l'injection de cellules souches dans le coussinet adipeux de souris dorsale de créer un In vivo Modèle de régénération glande sous-muqueuse.
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Article de méthode
Isolement de cellules basales et les cellules sous-muqueux du canal de la glande de la souris Trachée
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les grandes voies aériennes sont directement en contact avec l'environnement et donc vulnérables aux blessures des toxines et des agents infectieux qui nous souffle dans 1. Les grandes voies aériennes exigent donc un mécanisme de réparation efficace pour protéger nos corps. Ce processus de réparation se produit à partir de cellules souches dans les voies respiratoires et d'isoler ces cellules souches à partir des voies respiratoires est importante pour comprendre les mécanismes de réparation et de régénération. Il est également important pour la compréhension de réparation anormale qui peut conduire à des maladies des voies respiratoires 2. Le but de cette méthode est d'isoler une population de cellules souches roman de la souris conduits des glandes sous-muqueuses trachéales et de placer ces cellules in vitro et dans des modèles in vivo pour identifier les mécanismes de réparation et de régénération des glandes sous-muqueuses 3. Cette production présente des méthodes qui peuvent être utilisées pour isoler et doser les cellules souches conduit et de la base de la grande voies respiratoires 3. Cela nous permettrapour étudier les maladies des voies respiratoires, comme la fibrose kystique, l'asthme et la bronchopneumopathie chronique obstructive. À l'heure actuelle, il n'existe pas de méthodes d'isolement des cellules des glandes sous-muqueuses conduit et il n'y a pas de modèles in vivo pour étudier la régénération des glandes sous-muqueuses.
Protocole
Aperçu des étapes
1. Dissection de la trachée
2. Nettoyage de la trachée et le couper
3. Digestion enzymatique et la transformation en suspension cellulaire unique
4. Coloration pour FACS et le tri
5. Le traitement de cellules triées in vivo et in vitro sur des modèles
1. Dissection de la trachée
- Euthanasier la souris avec une injection intrapéritonéale de 0,1 mg/0.2 cc de pentobarbital.
- Couper la paroi abdominale, et déplacer l'intestin vers le côté pour e....
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Discussion
Cette technique conduit à isoler des cellules basales et des voies respiratoires est importante pour améliorer notre compréhension de la réparation des voies respiratoires et de la régénération et de maladies des voies respiratoires. Les techniques décrites ici sont quelques critiques. La première est la période de digestion enzymatique optimisé. Le second est la création d'une suspension cellulaire unique à travers passage en série avec des aiguilles de jauge progressivement plus élevés pour éviter cisaillement cel.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous tenons à remercier les grandes souches cellulaires FACS Centre de Recherche et surtout remercier Jessica Scholes et Felicia Codrea pour leur aide dans le tri cellulaire. Le travail a été financé par le CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, l'American Thoracic Society / MPOC Fondation ATS-06-065, La Fondation Concern, UCLA Jonsson Le Comprehensive Cancer Center SPORE thoracique Cancer Oncology Program / poumon, le cancer de l'Université de Californie coordination de la recherche et du Comité Gwynne Hazen cerise Memorial Laboratories (BG).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| Milieu complet 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) | Mediatech | 15-090 CV- | |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 | |
| Le bicarbonate de sodium (3,6 mm ou 0,03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005 Cl- | |
| Pénicilline (100 U / ml) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Streptomycine (100 ug / m) | Mediatech | 30-001-CI | |
| L'amphotéricine B (0,25 pg / ml) | Lonza | 17-836R | |
| EnSulin (10 pg / ml) | Sigma | I6634 | |
| Transferrine (5 ug / ml) | Sigma | T1147 | |
| La toxine du choléra (0,1 pg / ml) | Sigma | C8052 | |
| Le facteur de croissance épidermique (25 ng / ml) | BD | 354001 | |
| Extrait pituitaire bovin (30 pg / ml) | Invitrogen | 13028-014 | |
| Sérum de veau fœtal (5%) | Pêcheur | SH3008803HI | |
| L'acide rétinoïque (0,05 uM) | Sigma | R2625 | |
| Facteur de croissance réduit Matrigel | BD | 354230 |
Tableau 1. Remplissez composantes médias.
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pronase | Roche | 10165921001 | Utilisé à 0,15%: -O / n à 4 ° C pour isoler la digestion nombre total de cellules trachéales (pour la culture ALI) -4 Digestion h 4 ° C pour isoler SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Utilisé à 16 unités: 30 min à température ambiante |
| DNase I | Sigma | DN25 | Utilisé à raison de 0,5 mg / ml: 20-30 min à température ambiante |
Les enzymes du tableau 2. Utilisée pour la digestion enzymatique de la trachée.
Références
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E.
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Réimpressions et autorisations
