Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) à l'aide Drosophila Tissus

Résumé

Récemment la technologie de séquençage à haut débit a considérablement augmenté la sensibilité de la chromatine immunoprécipitation (ChIP) expérience et son invité application à l'aide des cellules purifiées ou de tissus disséqués. Ici, nous délimiter une méthode pour utiliser la technique ChIP avec Drosophila, qui peut traiter de l'état chromatine endogène dans un système bien caractérisé biologique.

Résumé

L'épigénétique reste un domaine en développement rapide qui étudie la façon dont l'Etat contribue à la chromatine expression différentielle des gènes dans des types cellulaires distincts à différents stades de développement. Régulation épigénétique contribue à un large éventail de processus biologiques, y compris la différenciation cellulaire au cours du développement embryonnaire et de l'homéostasie à l'âge adulte. Une stratégie essentielle dans les études épigénétiques est d'examiner comment diverses modifications des histones et des facteurs de la chromatine réguler l'expression génique. Pour résoudre ce problème, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est largement utilisé pour obtenir un instantané de l'association de facteurs particuliers avec de l'ADN dans les cellules d'intérêt.

Technique de ChIP utilise couramment des cellules en culture comme matériau de départ, qui peut être obtenu en abondance et d'homogénéité pour générer des données reproductibles. Cependant, il ya plusieurs mises en garde: Tout d'abord, l'environnement de cultiver des cellules dans les boîtes de Pétri est différente de celle in vivo, ce qui peutreflète pas l'état chromatine endogène des cellules dans un organisme vivant. Deuxièmement, tous les types de cellules peuvent être cultivées ex vivo. Il ya seulement un nombre limité de lignées cellulaires, à partir de laquelle les gens peuvent obtenir suffisamment de matériel pour le dosage ChIP.

Nous décrivons ici une méthode pour faire l'expérience en utilisant des tissus de Drosophila ChIP. Le matériau de départ est disséqué les tissus d'un animal vivant, ce qui peut refléter l'état chromatine endogène. L'adaptabilité de cette méthode avec beaucoup de différents types de tissus permettra aux chercheurs de répondre beaucoup plus biologiquement questions pertinentes relatives à la régulation épigénétique in vivo ^{1, 2.} En combinant cette méthode avec séquençage à haut débit (ChIP-seq) sera en outre permettre aux chercheurs d'obtenir un paysage épigénomique.

Protocole

(La procédure puce entière prend environ deux jours. Préparation des bibliothèques de puces pour séquençage à haut débit prend un autre 2-3 jours.)

1. Disséquer et préparer les tissus pour l'expérience ChIP (~ 1 million de cellules)

1. Disséquer les tissus d'intérêt (par exemple 200 paires de Drosophila testicules) dans du PBS froid + inhibiteur de la protéase 1x (dissoudre 1 pastille de cocktail d'inhibiteurs de protéase dans 1,5 ml de PBS 1x pour obtenir une solution stock de 7x) + PMSF (concentration finale 100 pg / mL). Rincer le tissu deux fois et remettre en suspension des tissus dans 20....

Discussion

La polyvalence des analyses ChIP abordés dans le présent protocole peut être utilisé sur différents tissus, qui prévoit la possibilité d'étudier l'état de la chromatine dans un système biologiquement pertinentes. Expériences utilisant des cellules de ChIP systèmes de culture sont commodes à réaliser parce que grande quantité de cellules peut être facilement obtenu. Cependant, les cellules cultivées ne reflètent pas nécessairement les cellules dans un environnement multi-cellulaire. En développant cette technique.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Complete cocktail Mini inhibiteur de la protéase	Roche	11836153001
Le formaldéhyde (37%)	Supelco	47083-U
PMSF	Sigma	78830
Kontes culot pilon	Fischer Scientific	K749521-1590
Kit de purification PCR	Qiagen	28104
Polyacrylamide linéaire	Sigma	56575-1ML
Le glycogène	Qiagen	158930
SYBR green / ROX qPCR Master Mix	Fermentas	K0223
Mini plaque de spinner	Labnet	Z723533
PCR en temps réel du système	Applied Biosystem	4351101
Processeur petit volume à ultrasons	Misonix	HS-XL2000	Modèle interrompu
Dynabeads, la protéine A	Invitrogen	100-01D
Dynamag aimant	Invitrogen	123-21D
Phénol: Chlorofrom: IAA	Invitrogen	15593-049
Epicentre d'ADN FIN-kit de réparation	Biotechnologies Epicentre	ER0720
MinElute reactioKit de nettoyage n	Qiagen	28204
Fragment de Klenow (3 '→ 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
ADN ligase de T4	Promega Corporation	M1794
Adaptateur oligonucléotides	Illumina	PE-400-1001
Primer Paired-End 1,0 et 2,0	Illumina	1001783 1001 784
Système Electorphoresis E-Gel	Invitrogen	G6512ST
2X Phusion HF Mastermix	Finnzymes	F-531