Identification et caractérisation des glycosylation des protéines spécifiques en utilisant des endo-et exoglycosidases

Summary

Utiliser glycosidases spécifiques pour éliminer les sucres de glycoprotéines suivi par SDS-PAGE est une méthode utile pour détecter des modifications glycane sur des échantillons de protéines et est un bon choix pour des études glycobiologie initiale. Les changements suivants déglycosylation peuvent être détectés comme des changements dans la mobilité de gel ou par coloration avec glycane réactifs sensibles.

Abstract

Glycosylation, l'addition de sucres liés de façon covalente, est une importante modification post-traductionnelle des protéines qui peuvent affecter de manière significative les processus tels que l'adhésion cellulaire, le trafic moléculaire, dégagement, et ^1-4 transduction du signal. Chez les eucaryotes, les modifications de la glycosylation les plus courantes dans la voie de sécrétion sont des ajouts au niveau des résidus asparagine consensus (N-liés); ou à résidus serine ou thréonine (O-lié) (figure 1). Initiation de la N-glycanes de synthèse est très conservée chez les eucaryotes, tandis que les produits finaux peuvent varier considérablement entre les différentes espèces, les tissus ou les protéines. Certains glycanes sont pas modifiées («high mannose N-glycanes») ou sont traitées ultérieurement dans le Golgi ("complexe N-glycanes»). Une plus grande diversité se trouve pour O-glycanes, qui commencent par une commune N-acétylgalactosamine (GalNAc) de résidus dans les cellules animales, mais diffèrent dans les organismes inférieurs ^1. ent "> L'analyse détaillée de la glycosylation des protéines est un domaine en soi et nécessite d'importantes ressources et l'expertise pour exécuter correctement. Cependant une variété d'enzymes disponibles que les sucres supprimer (glycosidases) rend possible d'avoir une idée générale de l'état de glycosylation des . protéine dans un laboratoire standard ici, nous illustrons l'utilisation de glycosidases pour l'analyse d'une glycoprotéine modèle:. gonadotrophine chorionique humaine recombinante bêta (hCGβ), qui porte deux N-glycanes et quatre O-glycanes ⁵ La technique ne nécessite que simples l'instrumentation et des consommables typique, et il peut être facilement adapté à l'analyse des échantillons glycoprotéine multiples.

Plusieurs enzymes peuvent être utilisées en parallèle pour étudier une glycoprotéine. PNGase F est capable d'éliminer presque tous les types de N-glycanes ^6,7. Pour O-glycanes, il n'ya pas d'enzymes disponibles qui peuvent cliver un oligosaccharide intact depuis èmesquelette protéique e. Au lieu de cela, O-glycanes sont garnis par des exoglycosidases à une courte carotte, qui est alors facilement enlevé par O-glycosidase. Le Grand Mix déglycosylation protéine contient PNGase F, O-glycosidase, la neuraminidase (sialidase), β1-4 galactosidase et β-N-acétylglucosaminidase. Il est utilisé pour retirer simultanément N-glycanes et certains glycanes ^O-8. Enfin, le Mix déglycosylation a été complétée avec un mélange de exoglycosidases autres (α-N-acétylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3, 6 galactosidase, et β1-3 galactosidase), qui aident à éliminer les monosaccharides contraire résistants qui pourraient être présents dans certains O-glycanes.

SDS-PAGE/Coomasie bleu est utilisé pour visualiser les différences en matière de migration des protéines avant et après traitement glycosidase. En outre, un sucre spécifique méthode de coloration, Proq Emeraude-300, montre que le signal diminue glycanes sont successively enlevé. Ce protocole est conçu pour l'analyse de petites quantités de glycoprotéines (0,5 à 2 ug), bien que déglycosylation enzymatique peut être étendu pour accueillir de grandes quantités de protéines que nécessaire.

Protocol

1. Déglycosylation enzymatique

1. Utiliser des tubes de PCR afin de minimiser la perte d'eau due à l'évaporation. Repérer un ensemble de tubes 1 à 7.
2. Décongelez le tampon 10X G7, le tampon 10X glycoprotéine dénaturation, et les 10% NP-40 et tapotez doucement les tubes pour mélanger le contenu. Conserver à température ambiante.
3. Placer les flacons contenant des enzymes sur la glace. Essayez de minimiser le dégel / gel cycles.
4. Dissoudre le contenu du flacon hCGβ (150 ug) dans 600 pi de dH ₂ O et de garder sur la glace.
5. Préparer 1 ml de tampon 1X G7 en diluant le stock 10X en DH ₂ O.
6. Diluer 0,5 pl de la PNGase F dans 25 pi de tampon 1X G7 et de garder sur la glace.
7. Préparer le mélange exoglycosidase (mix EG) en combinant 2 pl chacune des α-N-acétylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1-3 galactosidase, et α1-3, 6 galactosidase.
8. Mettre en place des tubes de PCR comme indiqué:

ak »>

Tube / échantillon #	1	2	3	4	5	6	7
hCGβ (0.25mg/ml)	9μl	9μl	9μl	9μl	-	-	-
Glycoprotéine 10X tampon dénaturant	1 microlitre	1 microlitre	1 microlitre	1 microlitre	1 microlitre	1 microlitre	1 microlitre
dH 2 O	-	-	-	-	9μl	9μl	9μl

9. Boucher les tubes, mélanger délicatement et placer dans lethermocycleur, fermer le couvercle et dénaturer les protéines par incubation de 10 minutes à 94 ° C, suivie d'un 4 ° C détiennent (en utilisant des tubes PCR dans un thermocycleur empêche grandement l'évaporation dans les échantillons de petit volume).
10. Retirer les tubes du thermocycleur et centrifugeuse pour éliminer toute condensation visible.
11. Ajouter les réactifs suivants comme indiqué:

Exemple #	1	2	3	4	5	6	7
10% de NP-40	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl
Tampon 10X G7	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5 & mu; L	2.5μl
PNGase F 01h50 dil.	-	2μl	-	-	2μl	-	-
Mélanger déglycosylation	-	-	2μl	2μl	-	2μl	2μl
Mélangez EG	-	-	-	2μl	-	-	2μl
dH 2 O	10 ul	8μl	8μl	6μl	8μl	8μl	6μl
Vol total de la réaction.	25 L μ	25 L μ	25 L μ	25 L μ	25 L μ	25 L μ	25 L μ

12. Fermer les tubes PCR utilisant des amorces de nouvelles (jeter celles qui sont utilisées car elles ne s'adaptent pas correctement après un cycle d'incubation).
13. Mélanger les tubes en tapotant délicatement 4 fois, puis tourner le contenu vers le bas.
14. Placer les tubes dans le thermocycleur et incuber à 37 ° C pendant 4 heures puis laisser refroidir les échantillons à 4 ° C.

2. SDS-PAGE des échantillons déglycosylé

1. Préparer 130 ul de tampon frais 3X réduction de la charge de SDS en ajoutant 4 pi de TNT 1.25M.
2. Ajouter 12,5 ul de la mémoire tampon 3X préparés de chargement réduisant SDS à chaque échantillon.
3. Fermer les tubes avec des bouchons de nouvelles et tapotez doucement les tubes pour mélanger.
4. Incuber les tubes dans un thermocycleur à 94 ° C pendant 5 minutes puis refroidir à 4 ° C.
5. Charge 30 ul de chaque échantillon et 10 pi de la protéine de marqueur sur un 10-20% Tris-Glycine gel. Enregistrer le reste de l'échantillon pour la partie 3.1. Charge 10 pi de marqueur protéique ColorPlus précolorés.
6. Electrophorèse gel à 130 volts à température ambiante jusqu'à ce que le front se trouve près du bas du gel.
7. Lorsque le gel a fini, enlever le gel de la fonte et le placer dans une petite boîte en plastique avec assez de Coomassie bleuissement pour couvrir le gel.
8. Stain le gel pendant 1 heure sous agitation douce.
9. Lavez les trois moments de gel pendant 30 minutes dans 50 ml de solution Décolorer.
10. Enregistrez les images en utilisant un transilluminateur lumière blanche ou un scanner. Sinon, le gel peut être séché entre des feuilles de cellophane dans un cadre.

3. Pro-Q Emerald 300 pour la détection des protéines glycosylées de gels SDS-PAGE

1. En parallèle avec le gel de 2,1), charge le reste des échantillons sur un 10-20% Tris-Glycine gel. Charge 10 & mu; L de protéines marqueurs ColorPlus précolorés.
2. Alors que le gel est en marche dissoudre le réactif Pro-Q émeraude avec du DMF et de préparer le correctif stock, Laver et oxydantes des solutions pour l'Emeraude de Pro-Q 300 tache suivant le manuel du produit fournie avec le kit.
3. Lorsque l'électrophorèse est terminée, enlever le gel de fonte et le placer dans une boîte en plastique.
4. Fixer le gel en ajoutant 100 ml de la solution Fix et c'est une nuit à température ambiante sous agitation douce.
5. Laver le gel avec 100 ml de la solution de lavage de 10 à 20 minutes à température ambiante sous agitation Gentile. Répéter le lavage avec la solution de lavage frais.
6. Oxyder les hydrates de carbone en incubant le gel avec une agitation douce pendant 30 minutes dans 25 ml de solution oxydante.
7. Laver le gel comme décrit dans l'étape 3.5.
8. Alors que le gel est de préparer le lavage douce Pro-Q Emerald 300 tache en ajoutant 500 pl de la solution Pro-Q Emeraude réactif dissous 300 à l'étape 3.2 à 25 ml decoloration tampon fourni dans le kit.
9. Stain le gel en ajoutant 25 ml de la tache préparé à l'étape 3.8 et l'incubation dans l'obscurité sous agitation douce pendant 90 à 120 minutes.
10. Répétez les deux étapes de lavage décrite à l'étape 3.5.
11. Enregistrer les images avec un transilluminateur d'UV à 300nm. Utilisez le marqueur de 80 kDa, qui est étiqueté avec Pro-Q vert émeraude, le chevauchement de l'image à une image UV lumière blanche du gel montrant l'échelle précolorés.
12. Comparez les images du gel Coomassie teinté à l'étape 2.10 avec le gel d'Emeraude Pro-Q teinté de l'étape 3.11.

4. Les résultats représentatifs

Les changements dans la migration des protéines enzymatiques après déglycosylation sont présentés dans la figure 2. Comparer l'échantillon de contrôle (panneau A, ligne 1) avec le traitement PNGase F (élimination des N-glycanes, piste 2), et Mix déglycosylation (PNGase F; ainsi endo-et exoglycosidases pour enlever O-glycanes, piste 3). Aucune autre réductionla taille est observée après digestion par des glycosidases supplémentaires (piste 4). Outre un changement de masse, les bandes deviennent plus nettes que les glycanes sont supprimés. Une bande fonctionnant sous le marqueur de 17 kDa (astérisque) représente l'parfaitement déglycosylé hCGβ polypeptide (MW: 16 kDa). D'autres bandes pourraient découler de déglycosylation incomplètes ou multiples à partir des protéines non identifiés présents dans l'échantillon hCGβ (voir ligne 1). Lanes 5 à 7 (contrôles) montrent les bandes correspondant aux glycosidases.

La coloration par le vert émeraude glycoprotéine est montré dans le panneau B. Ce réactif s'oxyde et les taches de tous les glycanes présents dans une molécule de protéine. Par conséquent, l'intensité du signal diminue à mesure que hCGβ est enzymatiquement déglycosylé (voies 1 à 4 voies). Le signal résiduel dans les couloirs 3 et 4 indiquent la présence de motifs glycane, qui sont résistants aux enzymes utilisées. Les glycosidases supplémentaires utilisées dans la piste 4 enlever un peu de résidus de sucre supplémentaire: la migration des protéines est le même, maisune légère réduction de l'intensité de la coloration peut être vu. Fractions de sucre résistant n'étaient pas présents dans toutes les espèces de protéines: certaines bandes n'ont pas été détectés par Emerald Green (absente dans l'image UV, entre parenthèses), indiquant qu'ils ont été largement déglycosylé. Des données additionnelles de soutien à la conclusion que hCGβ est hétérogène glycosylée. La bande inférieure sur la voie 2 (flèche) est faible sur l'image vert émeraude, tandis que la bande supérieure sur la piste 2 est lumineux, ce qui indique que de nombreux groupes de glycanes sont toujours présents. Ces données appuient la conclusion que hCGβ recombinant exprimé dans des cellules de souris contient glycoformes multiples ^9. Ces glycoformes différentes sont dues à l'hétérogénéité inhérente de la glycosylation des polypeptides où certains ne reçoivent pas un glycane dans chaque site de consensus et / ou certains glycanes sont étendues tandis que d'autres, même sur la même protéine ne sont pas.

Figure 1.Modèles de glycosylation typiques pour sécrétée ou glycoprotéines de surface cellulaire.

Figure 2. Gels SDS-PAGE montrant déglycosylation enzymatique de hCGβ. Le panneau A montre une coloration bleue Coomassie tout panneau B montre les résultats de Pro-Q Emerald 300 pour la visualisation des protéines glycosylées. Numéro de l'échantillon: 1, le contrôle hCGβ; 2, PNGase F digestion; 3, la digestion Mix déglycosylation; 4, ainsi que la digestion Mix déglycosylation exoglycosidases, des échantillons de 5 à 7 sont les contrôles réactifs (O-Glyc, O-glycosidase; GNA, β-N acétylglucosaminidase; Fucosidase Gal / FUC, β1-3 galactosidase, α1-3, 6 galactosidase, et α1-2; Galna, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu, la neuraminidase; PNGase; PNGase F)

Discussion

La méthode décrite ici en utilisant déglycosylation enzymatique et SDS-PAGE peut fournir des informations précieuses sur l'état de glycosylation d'une protéine d'intérêt, tandis que glycane réactifs spécifiques de faciliter l'interprétation des données. Ce protocole est destiné à des études initiales de la glycosylation des protéines et il est particulièrement adapté pour la sécrétion et de glycoprotéines membranaires des cellules de mammifères: les enzymes choisies dans ce cas sera spécifiquement supprimer tous les N-glycanes, et ou N-glycanes plus et les sucres les plus courants l'extension et formant le noyau de O-glycanes. Glycosidases ont l'avantage supplémentaire d'être doux, comparé aux méthodes déglycosylation chimique, en préservant l'intégrité de sucres et de protéines épine dorsale.

Pour élucider le taux d'occupation (dont les acides aminés sont glycosylés), l'étendue de la glycosylation, ou pour déterminer la structure fine des glycanes, des techniques plus sophistiquées telles que mspectrométrie de cul, la chromatographie liquide ou RMN sont nécessaires.

En raison de sa simplicité, plusieurs étapes de ce protocole peut être ajustée, substitué, et / ou combinés pour s'adapter aux divers besoins expérimentaux. Toutefois, afin d'obtenir des résultats qui peuvent être clairement interprétée, il est important de comprendre ses forces et ses limites. Tout d'abord, la spécificité et la pureté de l'glycosidases sont cruciales: que les enzymes bien caractérisées testé pour être libre de protéases et d'autres activités de contamination doivent être utilisés. Malheureusement, il n'existe pas de définition standard de l'enzyme unité pour les glycosidases, l'utilisateur doit déterminer la substitution appropriée conformément aux spécifications du fabricant. Deuxièmement, un choix judicieux de détection est nécessaire: une réactifs) Coloration des protéines ne sont utiles que si les résultats déglycosylation à un changement important dans la masse moléculaire. Un tel résultat clair comme montré ici n'est pas toujours obtenue. Dans d'autres cas, nous avons vu mi anormalegration après déglycosylation (loin d'être le poids moléculaire prédit, ou la migration encore plus lent). Ce phénomène n'est pas bien comprise, mais on peut dire que tout changement dans la migration est la preuve que la protéine a été déglycosylé. B) la détection de sucre avec des anticorps présente des défis uniques en limitant leur applicabilité. Il a été très difficile de générer générale anti-glycane anticorps, ils sont généralement soulevées contre une cible complexe glycane, ce qui restreint leur utilisation. Par ailleurs, plusieurs anticorps monoclonaux anti-glycane anticorps affichage indésirable réactivité croisée ^10. C) Les lectines (protéines ayant une affinité de sucre intrinsèque) sont bien adaptés pour la détection de sucre, plus ils donnent un aperçu sur la structure du glycane. Cependant, pas tous d'entre eux ont une spécificité étroite, et beaucoup ne sont que partiellement caractérisé (ce qui signifie qu'ils pourraient avoir des affinités inconnues). Comme une coloration lectine conséquence positive fournit une indication, pas une preuve, de la présence d'une IGême sucre. d) des kits d'étiquetage de produits chimiques (basée sur l'oxydation au periodate de sucres) sont la méthode de choix pour colorer toutes les glycoprotéines, et donc bien adapté pour suivre déglycosylation.

Lors du traitement d'un échantillon inconnu, il est une bonne pratique d'inclure des contrôles glycoprotéine. Fétuine est un N aisément disponibles - et O-glycoprotéine; gonadotrophine chorionique (les deux sous-unités) est également un bon choix. Albumine sérique bovine (BSA) peut être utilisé comme contrôle négatif. Toutefois, il convient de noter que certaines protéines non glycosylées réagissent peu avec le Emerald Pro-Q 300, en particulier lorsqu'il est utilisé à des concentrations élevées. Non-glycosylée standards de poids moléculaire, tels que le marqueur protéique précolorés utilisé dans ce protocole, ont l'avantage d'afficher des bandes nettes. Ce n'est que par hasard est une de ces protéines (80 kDa) réactive à Pro-Q Emerald 300. Par conséquent, l'utilisateur pourrait vouloir lancer une échelle standard glycoprotéine lieu, comme Candy-canne de Invitrogen.

Enfin, simple en gel de détection de glycoprotéines nucleocytosolic (qui sont modifiées avec un seul O-GlcNAc) est possible avec l'utilisation d'un anticorps monoclonal, le long de β-N-acétylglucosaminidase pour ¹¹ contrôle de spécificité. La description de cette technique est au-delà des portée de cet article, mais il devrait être mentionné comme glycosidases sont des outils utiles pour l'étude de nombreuses autres glycoprotéines et glycoconjugués présents dans les cellules. Un traitement complet de toutes les formes connues de la glycosylation peuvent être trouvés dans la deuxième édition de la «Essentials of Glycobiologie», disponible gratuitement en ligne à l'étagère de NCBI (ID Bookshelf: NBK1908; PMID: 20301239) ^12.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Homme gonadotrophine chorionique β	Sigma-Aldrich	C6572
Tubes PCR	VWR	20170-004
PCR Thermocycleur	Applied Biosystems	4359659
PNGase F	New England Biolabs	P0704	Livré avec des tampons
Mélanger déglycosylation protéines	New England Biolabs	P6039	Livré avec des tampons
α-N-Acetylglalactosaminidase	New England Biolabs	P0734	Livré avec le tampon
α1-2 Fucosidase	New England Biolabs	P0724	Livré avec le tampon
α1-3, 6 Galactosidase	New England Biolabs	P0731	Livré avec le tampon
β1-3 Galactosidase	New England Biolabs	P0726	Livré avec le tampon
Tampon 10X G7 (500 mM phosphate de sodium)	New England Biolabs	---	Livré avec PNGaseF ou degl Mix
Tampon 10X glycoprotéine dénaturation (5% de SDS, 400 mM DTT)	New England Biolabs	---	Livré avec PNGaseF ou degl Mix
10% de NP-40	New England Biolabs	---	Livré avec PNGaseF ou degl Mix
3X tampon de charge SDS (187,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 6% de SDS, glycérol 30%, 0,03% Bromophenol bleu)	New England Biolabs	B7703	Livré avec 1,25 M de DTT
ColorPlus précolorés marqueur protéique	New England Biolabs	P7709
10-20% Tris-Glycine Multigel	Cosmo Bio Co.	DCB-414893
Unité d'électrophorèse cassette	Cosmo Bio Co.	DCB-303111
EPS électrophorèse Alimentation 301	GE Healthcare	18-1130-01
Pro-Q Kit Emeraude glycoprotéine 300 Stain	Invitrogen	P-21857
Brilliant Blue R	Sigma-Aldrich	B0149
AlphaImager système HP	Cellule Biosciences	92-13823-00