Isoler les microglies primaire à partir de l'hétérogénéité cellulaire du cerveau est essentielle pour enquêter sur leur rôle dans les deux conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole décrit une isolation mécanique et technique mixte de culture cellulaire qui fournit un rendement élevé et de haute pureté, viables primaires pour les cellules microgliales In vitro Étude et les applications en aval.
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Article de méthode
Isolement primaire microglies de cultures mixtes de cellules gliales de tissus de cerveau de rat nouveau-né
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les microglies représentent environ 12 % de la population cellulaire totale dans le cerveau des mammifères. Bien que les neurones et les astrocytes soient considérés comme les principaux types cellulaires du système nerveux, les microglies jouent un rôle important dans la physiologie normale du cerveau en surveillant les débris et les agents pathogènes présents dans les tissus et en maintenant l'homéostasie du parenchyme par une activité phagocytaire 1,2. Les microglies sont activées dans diverses conditions de lésion et de maladie, notamment les maladies neurodégénératives, les traumatismes crâniens et les infections du système nerveux 3. Dans ces conditions d'activation, les microglies augmentent leur activité phagocytaire, subissent des changements morphologiques et prolifératifs, et sécrètent activement des espèces réactives de l'oxygène et de l'azote, des chimiokines et des cytokines pro-inflammatoires, activant souvent une boucle paracrine ou autocrine 4-6. Étant donné que ces réponses microgliales contribuent à la pathogenèse des affections neurologiques, des recherches centrées sur les microglies sont justifiées.
En raison de l'hétérogénéité cellulaire du cerveau, il est techniquement difficile d'obtenir, lors d'expériences in vivo, une quantité suffisante d'échantillons de microglie avec une haute pureté. Les recherches actuelles sur les fonctions neuroprotectrices et neurotoxiques des microglies nécessitent une méthode technique standardisée permettant de produire de manière reproductible des microglies pures et saines, en quantité suffisante pour l'étude. Nous présentons, sous forme de texte et de vidéo, un protocole d'isolement de microglies primaires pures à partir de cultures mixtes de glie, destiné à diverses applications en aval. Brièvement, cette technique utilise des tissus cérébraux dissociés provenant de ratons néonatals afin de produire des cultures cellulaires gliales mixtes. Une fois les cultures gliales mixtes devenues confluentes, les microglies primaires sont isolées mécaniquement par une courte agitation de la culture. Les microglies sont ensuite mises en culture avec une haute pureté pour des études expérimentales.
Le principe et le protocole de cette méthode ont été décrits dans la littérature 7,8. Par ailleurs, d'autres méthodes pour isoler les microglies primaires sont bien documentées 9-12. Le tissu cérébral homogénéisé peut être séparé par une centrifugation en gradient de densité afin d'obtenir des microglies primaires 12. Toutefois, cette centrifugation, d'une durée modérée (45 min), peut provoquer des dommages cellulaires et une activation, ainsi qu'une enrichment en microglies et en autres populations cellulaires. Un autre protocole a été utilisé pour isoler des microglies primaires chez divers organismes, par agitation prolongée (16 h) en culture 9-11. Après agitation, le surnageant du milieu est centrifugé pour isoler les microglies. Cette méthode d'isolement en deux étapes, plus longue, peut également perturber la fonction et l'activation des microglies. Nous utilisons principalement le protocole d'isolement des microglies suivant dans notre laboratoire pour plusieurs raisons : (1) les microglies primaires reproduisent la biologie in vivo plus fidèlement que les lignées cellulaires de microglies de rongeurs immortalisées, (2) une perturbation mécanique minimale réduit au minimum les risques de dysfonctionnement ou d'activation cellulaires, et (3) un rendement suffisant peut être obtenu sans passage des cultures mixtes de cellules gliales.
Il est important de noter que ce protocole utilise des tissus cérébraux de rats nouveau-nés pour isoler les microglies, et que l'utilisation de rats plus âgés pour l'isolement des microglies peut influencer significativement le rendement, l'état d'activation et les propriétés fonctionnelles des microglies isolées. Des données montrent que le vieillissement est associé à un dysfonctionnement des microglies, à une neuroinflammation accrue et à des pathologies neurodégénératives ; c'est pourquoi des études antérieures ont utilisé des microglies adultes ex vivo afin de mieux comprendre le rôle des microglies dans les maladies neurodégénératives où le vieillissement constitue un paramètre important. Toutefois, les microglies ex vivo ne peuvent pas être maintenues en culture pendant de longues périodes. Par conséquent, bien que ce protocole prolonge la survie des microglies primaires en culture, il convient de noter que ces microglies présentent un comportement différent de celui des microglies adultes, et que les études in vitro doivent être soigneusement interprétées lorsqu'elles sont transposées à un contexte in vivo.
Protocole
1. Dissection des tissus de cerveau de rat nouveau-né
- Refroidissement Leibovitz L-15 milieux conditionnés (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) à 4 ° C. Milieux de culture chaudes (DMEM + 10% de FBS + 1% de pénicilline / streptomycine) à 37 ° C. Préparer 4 60x15 mm boîtes de Pétri avec 4-5 ml de L-15 climatisées médias sur la glace. Stériliser tous les instruments chirurgicaux avec de l'éthanol 100%.
- Rincer les chiots nouveau-nés P2 rap avec de l'éthanol 70%. (Ratons nouveau-nés âgés de P1 à P5 peut être utilisé dans ce protocole.)
- Rapidement décapiter un raton avec des ciseaux bien aiguisés stériles et déposer la tête....
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Discussion
Alors que ce protocole est régulièrement utilisé pour produire la microglie pur et sain pour les expériences de recherche, un examen attentif des aspects techniques au cours de parties critiques de la procédure permettra de minimiser la variabilité dans la microglie isolée. Tout d'abord, lors de la dissection du tissu cérébral de rats nouveau-nés petits, travaillant en temps opportun est nécessaire pour minimiser les dommages hypoxiques et ischémiques du tissu. Cependant, il est également important d'enlever com.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Financé par le programme intra-muros à l'Université en uniforme des services.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Le numéro de catalogue | Commentaires |
| 60 mm x 15 mm boîtes de Pétri | Fisher marque | 0875713A | |
| De Sharp ciseaux de dissection | Outils belle science | 14094-11 | |
| Dumont # 7b pince standard des conseils, des courbes, 11cm | Outils belle science | 11270-20 | |
| Dumont # 5 pince standard des conseils, des droites, 11 cm | Outils belle science | 11251-10 | |
| Tubes de 50 ml à centrifuger coniques | VWR | 89039-656 | |
| 5 pipettes sérologiques ml | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 pipettes sérologiques ml | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 um crépine stérile cellule de nylon | Faucon | 35-2360 | |
| 75 cm 2 flacons de culture tissulaire | Corning | 430641 | |
| Dulbecco milieu essentiel minimal (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz milieu L-15 | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Sérum de veau fœtal | Gibco (Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fœtale sérum équin | Pêcheur | SH3007402 | |
| La pénicilline-streptomycine | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| L'éthanol à 100% | La Société Warner Graham | 64-17-5 | |
| Phosphate solution saline tamponnée, 10X, pH 7,4 | Qualité biologique, inc. | 119-069-131 | 1X dans l'eau distillée stérile |
| Sacs de Biohazard | VWR | 14220-028 | |
| Hémocytomètre | Hausser scientifique | 1492 | |
| Des plaques 6 puits culture cellulaire avec une surface CellBIND | Corning | 3335 |
Références
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W.
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Réimpressions et autorisations
