Isolement primaire microglies de cultures mixtes de cellules gliales de tissus de cerveau de rat nouveau-né

Résumé

Isoler les microglies primaire à partir de l'hétérogénéité cellulaire du cerveau est essentielle pour enquêter sur leur rôle dans les deux conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole décrit une isolation mécanique et technique mixte de culture cellulaire qui fournit un rendement élevé et de haute pureté, viables primaires pour les cellules microgliales In vitro Étude et les applications en aval.

Résumé

Les microglies représentent environ 12 % de la population cellulaire totale dans le cerveau des mammifères. Bien que les neurones et les astrocytes soient considérés comme les principaux types cellulaires du système nerveux, les microglies jouent un rôle important dans la physiologie normale du cerveau en surveillant les débris et les agents pathogènes présents dans les tissus et en maintenant l'homéostasie du parenchyme par une activité phagocytaire ^1,2. Les microglies sont activées dans diverses conditions de lésion et de maladie, notamment les maladies neurodégénératives, les traumatismes crâniens et les infections du système nerveux ³. Dans ces conditions d'activation, les microglies augmentent leur activité phagocytaire, subissent des changements morphologiques et prolifératifs, et sécrètent activement des espèces réactives de l'oxygène et de l'azote, des chimiokines et des cytokines pro-inflammatoires, activant souvent une boucle paracrine ou autocrine ^4-6. Étant donné que ces réponses microgliales contribuent à la pathogenèse des affections neurologiques, des recherches centrées sur les microglies sont justifiées.

En raison de l'hétérogénéité cellulaire du cerveau, il est techniquement difficile d'obtenir, lors d'expériences in vivo, une quantité suffisante d'échantillons de microglie avec une haute pureté. Les recherches actuelles sur les fonctions neuroprotectrices et neurotoxiques des microglies nécessitent une méthode technique standardisée permettant de produire de manière reproductible des microglies pures et saines, en quantité suffisante pour l'étude. Nous présentons, sous forme de texte et de vidéo, un protocole d'isolement de microglies primaires pures à partir de cultures mixtes de glie, destiné à diverses applications en aval. Brièvement, cette technique utilise des tissus cérébraux dissociés provenant de ratons néonatals afin de produire des cultures cellulaires gliales mixtes. Une fois les cultures gliales mixtes devenues confluentes, les microglies primaires sont isolées mécaniquement par une courte agitation de la culture. Les microglies sont ensuite mises en culture avec une haute pureté pour des études expérimentales.

Le principe et le protocole de cette méthode ont été décrits dans la littérature ^7,8. Par ailleurs, d'autres méthodes pour isoler les microglies primaires sont bien documentées ^9-12. Le tissu cérébral homogénéisé peut être séparé par une centrifugation en gradient de densité afin d'obtenir des microglies primaires ¹². Toutefois, cette centrifugation, d'une durée modérée (45 min), peut provoquer des dommages cellulaires et une activation, ainsi qu'une enrichment en microglies et en autres populations cellulaires. Un autre protocole a été utilisé pour isoler des microglies primaires chez divers organismes, par agitation prolongée (16 h) en culture ^9-11. Après agitation, le surnageant du milieu est centrifugé pour isoler les microglies. Cette méthode d'isolement en deux étapes, plus longue, peut également perturber la fonction et l'activation des microglies. Nous utilisons principalement le protocole d'isolement des microglies suivant dans notre laboratoire pour plusieurs raisons : (1) les microglies primaires reproduisent la biologie in vivo plus fidèlement que les lignées cellulaires de microglies de rongeurs immortalisées, (2) une perturbation mécanique minimale réduit au minimum les risques de dysfonctionnement ou d'activation cellulaires, et (3) un rendement suffisant peut être obtenu sans passage des cultures mixtes de cellules gliales.

Il est important de noter que ce protocole utilise des tissus cérébraux de rats nouveau-nés pour isoler les microglies, et que l'utilisation de rats plus âgés pour l'isolement des microglies peut influencer significativement le rendement, l'état d'activation et les propriétés fonctionnelles des microglies isolées. Des données montrent que le vieillissement est associé à un dysfonctionnement des microglies, à une neuroinflammation accrue et à des pathologies neurodégénératives ; c'est pourquoi des études antérieures ont utilisé des microglies adultes ex vivo afin de mieux comprendre le rôle des microglies dans les maladies neurodégénératives où le vieillissement constitue un paramètre important. Toutefois, les microglies ex vivo ne peuvent pas être maintenues en culture pendant de longues périodes. Par conséquent, bien que ce protocole prolonge la survie des microglies primaires en culture, il convient de noter que ces microglies présentent un comportement différent de celui des microglies adultes, et que les études in vitro doivent être soigneusement interprétées lorsqu'elles sont transposées à un contexte in vivo.

Protocole

1. Dissection des tissus de cerveau de rat nouveau-né

1. Refroidissement Leibovitz L-15 milieux conditionnés (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) à 4 ° C. Milieux de culture chaudes (DMEM + 10% de FBS + 1% de pénicilline / streptomycine) à 37 ° C. Préparer 4 60x15 mm boîtes de Pétri avec 4-5 ml de L-15 climatisées médias sur la glace. Stériliser tous les instruments chirurgicaux avec de l'éthanol 100%.
2. Rincer les chiots nouveau-nés P2 rap avec de l'éthanol 70%. (Ratons nouveau-nés âgés de P1 à P5 peut être utilisé dans ce protocole.)
3. Rapidement décapiter un raton avec des ciseaux bien aiguisés stériles et déposer la tête immédiatement dans l'éthanol à 70%. Répétez l'opération pour un total de 5 ratons ensuite transférer la tête dans une solution saline.
4. Retirez les cerveaux entiers de la tête et les placer dans une boîte de Pétri avec 4 - 5 ml solution L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + 1% Pen / Strep) sur la glace.
5. Répéter les procédures 1.2 - 1.4 pour les chiots qui restent dans la litière.
6. Retirez les méninges du cerveau et de transférer le destissu cérébral IRED (c.-à-cortex, le cervelet, le cerveau entier, etc) dans un nouveau plat de Pétri avec 4-5 ml de solution de L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) sur la glace.

2. Préparation de la population de cellules gliales mixte

1. Sans endommager le tissu cérébral avec des ciseaux ou une lame, transférer le tissu avec une pipette de 10 ml à 50 ml une stérile tube conique.
2. Centrifuger conique à 2500 RCF pendant 5 min à 4 ° C.
3. Aspirer le surnageant. Ajouter 4-5 ml de frais L-15 médias (Leibowitz L-15 + 0,1% + 1% BSA Pen / Strep).
4. Introduire à la pipette des tissus de haut en bas 10 fois avec une pipette stérile de 10 ml.
5. Placer un tamis cellulaire (100 pores um) sur un nouveau tube de 50 ml conique. Tissus pipette de haut en bas une fois avec une solution stérile de pipette 5 ml et que la pipette au ras de la crépine cellule, distribuer le matériau à travers la crépine cellule dans le tube conique.
6. Rincer la crépine cellule avec 4-5 ml de frais L-15 médias (Leibowitz L-15 + 0,1% BSUn stylo + 1% / Strep).
7. Centrifuger conique avec des cellules tendues à 2500 RCF pendant 5 min à 4 ° C.

3. Placage et d'entretien des cultures mixtes de cellules gliales

1. Pour chaque cerveau de rat nouveau-nés traités, préparer 1 T-75 stériles flacon en ajoutant 12 ml de milieux de culture (DMEM + 10% de FBS + 1% de pénicilline / streptomycine) dans chaque flacon.
2. Aspirer le surnageant des cellules granulées et ajouter 5-6 ml de milieux de culture pour le culot cellulaire. Introduire à la pipette de haut en bas 10 fois avec une pipette de 10 ml.
3. Transférer un volume égal de suspension cellulaire dans chaque fiole T-75.
4. Incuber fioles dans un 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C pour un total de 1-3 semaines.
5. Flacons devrait d'abord être incubées pendant 5 jours, et le cinquième jour, remplacer les milieux de culture dans chaque flacon avec 12 ml de milieu frais et retourner à l'incubateur. Puis, tous les 3 jours, remplacer les milieux conditionnés dans chaque flacon avec 12 ml de milieu frais pour atteindre la confluence. Ce doit être le fairene très attentivement sans toucher le fond des flacons où les cellules se fixent.

4. Isolement et Revêtement de l'enseignement primaire microglies

1. Après mixtes cultures gliales sont complètement confluentes, retirez flacons de l'incubateur et les caches flacon avec du parafilm pour éviter les échanges gazeux avec l'air ambiant.
2. Agiter flacons à 100 RPS (Companion Lab SI-600, JEIO Tech) pendant 1 heure à 37 ° C.
3. Recueillir les médias de tous les flacons avec une pipette de 10 ml, sans perturber la couche d'astrocytes à la surface ballon. Placez le support dans des tubes de 50 ml coniques. Ajouter des milieux frais aux flacons et bouteilles de retour à l'incubateur.
4. Centrifuger les tubes coniques à 2500 RCF pendant 5 min à 4 ° C.
5. Aspirer surnageant de tous les tubes coniques. Les culots cellulaires sont élevés cellules de la microglie de pureté. Pellets Remettre en suspension dans 1 ml de placage microglie médias (DMEM + FES 10% + 1% de pénicilline / streptomycine).
6. Comptez la densité cellulaire dans les médias remises en suspension à l'aideun hémocytomètre.
7. Ajouter un volume approprié de géloses microglies pour atteindre un 2 x 10E5 cellules par ml de densité. Plate comme il convient pour l'analyse expérimentale.
8. Autoriser les microglies pour attacher la nuit.

5. Les résultats représentatifs

Le protocole décrit ci-dessus les résultats dans les cultures primaires de haute pureté microglie. Comme déterminé par immunohistochimie pour un marqueur cellulaire de macrophages / microglies spécifique (Iba1), plaqués cultures microglies sont> à 90% (figure 2). En outre, la coloration des marqueurs de cellules astrocytes, oligodendrocytes et des neurones spécifiques démontre une contamination minimale (figure 2). Après avoir établi mixtes cultures de cellules gliales, la microglie peut être isolé en secouant jusqu'à 4 fois successives. L'isolement initial microglie donnera environ 2,2 x 106 cellules / ml ou environ 9 millions de cellules par 10 flacons et le rendement attendu diminue à chaque sha successifske. La microglie isolés par cette méthode ont été utilisées avec succès pour étudier la capacité de phagocytose, la fonction, comme la production d'oxyde nitrique, et la toxicité neuronale (Figure 3) ^13-14.

Figure 1. Vue d'ensemble du protocole de préparation de cultures mixtes de cellules gliales et l'isolement de la microglie primaire.

Figure 2. Isolement de la microglie de haute pureté tel que vérifié par une analyse immunohistochimique utilisant la microglie (Iba-1, rouge), des astrocytes (GFAP, vert), neurone (NeuN, rouge) et des oligodendrocytes (CC1, rouge) des marqueurs spécifiques. La coloration de l'ADN des cellules en culture par DAPI (en bleu) est également indiquée.

Figure 3. Microglie isolés dans la descri méthodelit ont été utilisées dans un certain nombre de tests, y compris, mais sans s'y limiter, les dosages, les dosages de la fonction de phagocytose et des études de neurotoxicité. Dans ces études, nous avons constaté que la microglie (Iba-1 positive, vert), lorsqu'ils sont exposés à contrôler (A) ou LPS (B) des médias traités, augmenter leur phagocytose de billes de latex marquées par fluorescence (rouge), qui peuvent être quantifiées ( C). En outre, le LPS (1ng/ml) le traitement peut augmenter la production d'oxyde nitrique dans la microglie (D). Enfin, via à la fois transwell insert-séparés ou directs microglie-neurones cultures, nous avons constaté que les microglies incubées avec LPS peuvent induire la mort des cellules neuronales, telle que mesurée par la lactate déshydrogénase (LDH) de libération (E, F).

Discussion

Alors que ce protocole est régulièrement utilisé pour produire la microglie pur et sain pour les expériences de recherche, un examen attentif des aspects techniques au cours de parties critiques de la procédure permettra de minimiser la variabilité dans la microglie isolée. Tout d'abord, lors de la dissection du tissu cérébral de rats nouveau-nés petits, travaillant en temps opportun est nécessaire pour minimiser les dommages hypoxiques et ischémiques du tissu. Cependant, il est également important d'enlever com...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Le numéro de catalogue	Commentaires
60 mm x 15 mm boîtes de Pétri	Fisher marque	0875713A
De Sharp ciseaux de dissection	Outils belle science	14094-11
Dumont # 7b pince standard des conseils, des courbes, 11cm	Outils belle science	11270-20
Dumont # 5 pince standard des conseils, des droites, 11 cm	Outils belle science	11251-10
Tubes de 50 ml à centrifuger coniques	VWR	89039-656
5 pipettes sérologiques ml	Grenier Bio One	606180
10 pipettes sérologiques ml	Grenier Bio One	607180
100 um crépine stérile cellule de nylon	Faucon	35-2360
75 cm 2 flacons de culture tissulaire	Corning	430641
Dulbecco milieu essentiel minimal (DMEM)	Gibco (Invitrogen)	31053-028
Leibovitz milieu L-15	Gibco (Invitrogen)	11415064
Sérum de veau fœtal	Gibco (Invitrogen)	16000-036
Fœtale sérum équin	Pêcheur	SH3007402
La pénicilline-streptomycine	Gibco (Invitrogen)	15140163
L'éthanol à 100%	La Société Warner Graham	64-17-5
Phosphate solution saline tamponnée, 10X, pH 7,4	Qualité biologique, inc.	119-069-131	1X dans l'eau distillée stérile
Sacs de Biohazard	VWR	14220-028
Hémocytomètre	Hausser scientifique	1492
Des plaques 6 puits culture cellulaire avec une surface CellBIND	Corning	3335