La culture et les applications de rotation bioréacteur de la paroi vasculaire dérivé de modèles 3D de cellules épithéliales

Résumé

Système de pile à rotation culture qui permet aux cellules épithéliales de croître dans des conditions physiologiques résultant en 3-D formation d'agrégats cellulaires est décrite. Les agrégats généré affichage In vivo-Comme des caractéristiques non observées dans les modèles classiques de culture et de servir en tant que système modèle organotypique plus précis pour une multitude d'enquêtes scientifiques.

Résumé

Les cellules et les tissus dans les conditions de l'expérience du corps de l'environnement qui influent sur leur architecture, les communications intercellulaires et les fonctions globales. Pour des modèles in vitro de cultures cellulaires avec précision imiter le tissu d'intérêt, le milieu de croissance de la culture est un aspect essentiel à considérer. Couramment utilisés les systèmes classiques de culture cellulaire de propager des cellules épithéliales sur le plat en deux dimensions (2-D) des surfaces imperméables. Bien que beaucoup ait été tirées de systèmes classiques de culture cellulaire, de nombreuses conclusions ne sont pas reproductibles dans des essais cliniques humains ou des explants de tissus, ce qui pourrait à la suite de l'absence d'un micro-physiologiquement pertinent.

Ici, nous décrivons un système de culture qui permet de surmonter bon nombre des limites des conditions de culture de 2-D des cultures de cellules, en utilisant la rotation innovant paroi de la cuve (RWV) la technologie des bioréacteurs. Nous et d'autres ont montré que organotypiques RWV dérivés des modèles peut récapituler structure, la fonction et authentiques réactions humaines à des stimuli externes de même pour les tissus humains explants ^1-6. Le bioréacteur RWV est un système de culture en suspension qui permet la croissance des cellules épithéliales dans des conditions de cisaillement faible physiologiques fluide. Les bioréacteurs sont de deux formats différents, un récipient à haute élément rotatif (HARV) ou un navire rotation lente latérale (STLV), dans laquelle ils diffèrent par leur source d'aération. Cellules épithéliales sont ajoutés au bioréacteur de choix en combinaison avec poreux, des billes microsupports revêtus de collagène (figure 1A). Les cellules utilisent les perles comme un échafaudage de croissance au cours de la baisse constante gratuitement dans le bioréacteur (figure 1B). Le microenvironnement fournies par le bioréacteur permet aux cellules de former des agrégats tridimensionnels (3-D) présentant in vivo des caractéristiques similaires souvent pas respectées en vertu de la norme 2-D des conditions de culture (figure 1D). Ces caractéristiques comprennent des jonctions serrées, le MUCnous la production, apicale / basale d'orientation, dans la localisation des protéines in vivo, ainsi que d'autres cellules épithéliales de type des propriétés spécifiques.

La progression d'une monocouche de cellules épithéliales à un totalement différenciées en 3-D agrégat varie en fonction de type ¹ de ^{cellules, 7-13.} Échantillonnage périodique du bioréacteur permet de surveiller la formation d'agrégats épithéliale, marqueurs de différenciation cellulaire et la viabilité (figure 1D). Une fois la différenciation cellulaire et la formation d'agrégats est établi, les cellules sont récoltées à partir du bioréacteur, et des tests similaires réalisés sur 2 D-cellules peuvent être appliqués aux agrégats 3-D avec quelques considérations (figure 1E-G). Dans ce travail, nous décrivons les étapes détaillées de la façon dont la culture en 3-D des agrégats de cellules épithéliales dans le système de bioréacteur RWV et une variété de dosages potentiels et des analyses qui peuvent être exécutées avec les agrégats 3-D. Ces analyses comprennent, mais ne sont pas limités à, structurel / manalyse orphological (confocale, de numérisation et microscopie électronique à transmission), cytokine / chimiokine sécrétion et la signalisation cellulaire (cytométrie tableau talon et à l'analyse Western blot), l'analyse d'expression génique (PCR en temps réel), toxicologiques / analyse des médicaments et interactions hôte-pathogène. L'utilisation de ces tests a jeté les bases pour des études plus approfondies et expansive comme la métabolomique, la transcriptomique, la protéomique et d'autres applications basées sur réseau. Notre objectif est de présenter des moyens non conventionnels de la culture de cellules épithéliales humaines pour produire organotypiques modèles 3-D qui récapitulent l'humain dans des tissus in vivo, dans un système facile et robuste pour être utilisé par les chercheurs avec les divers intérêts scientifiques.

Protocole

Toutes les mesures doivent être effectuées sous BSL-2 conditions dans une hotte à flux laminaire.

1. Préparation de la Bioréacteur STLV

1. Assembler le bioréacteur STLV selon le protocole du fabricant et effectuer le protocole de désintoxication pour assurer la stérilité du bioréacteur. Couvrir les ports ouverts avec des bouchons Luer et remplir le STLV avec de l'éthanol 95% pendant 24 h.
2. Retirer l'éthanol et de remplir le STLV avec de l'eau distillée stérilisée pendant 24 h.
3. Répétez l'étape 1.2 avec de l'eau distillée stérilisée seulement.
4. Avec l'outil fourni par le vendeur, d....

Discussion

L'utilisation de la technologie du bioréacteur RWV présenté ici peut fournir aux chercheurs la capacité de faire progresser leur système actuel de culture cellulaire à un modèle plus physiologiquement pertinente des cellules organotypique culture. Le bioréacteur RWV système de pile à la culture offre un microenvironnement faible cisaillement qui permet aux cellules de former en 3-D agrégats cellulaires in vivo avec des caractéristiques similaires, y compris les jonctions serrées, la production de mucine, le.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21131	Utilisé à 1:500 de dilution
FACSDiva	BD		Cytomètre en flux
β-tublin anticorps	Calbiochem	654162	Utilisé à 1:5000 dilution
Bio-Plex 2000	BioRad	171-000205	V5
Bioréacteur et des composants	Synthecon	CRCT-4
Tamis cellulaire	BD Falcon	352340	40 um taille de pores
Tube conique (50 ml)	Corning	5-538-60
Lamelles	VWR	48366067
Kits cytokines tableau de perles	BioRad	Personnalisé kit humaine
Perles Cytodex	Sigma	C3275
DPBS	Gibco	14190
EDTA	Sigma	ED-500G	L'acide éthylènediaminetétraacétique
Épithéliale anticorps spécifique (ESA)	Chemicon	CBL251	Utilisé à dilution 1:50
Sérum de veau fœtal (FBS)	Gibco	10438	Inactivé par la chaleur
HARV (jetable)	Synthecon	D-405
Acide chlorhydrique	Sigma	258148	37%
Anticorps involucrine	Sigma	Je 9018
Lames de microscope	VWR	16004-368
Réactif MTT	MP Biomedicals, LLC	194592	3 - (4,5-Dimethylthiazolyl 1-2) -2,5-diphényl tétrazolium bromure de
MUC1 anticorps (microscopie)	Santa Cruz	Sc-7313	Utilisé à dilution 1:50
MUC1 anticorps (cytométrie de flux)	BD Pharmingen	559774	Aussi appelé CD227, utilisez 20 pi par test
Paraformaldéhyde	Sciences Electron Microscopy	15710	Dilué à 4% dans du DPBS
Une boîte de Pétri (petit)	BD Falcon	353002
Tube en polystyrène avec filtre	BD Falcon	352235
Tube d'écoulement en polystyrène	BD Falcon	352058
PR d'anticorps	DAKO	M3569	Utilisé à 1:100 de dilution
Or ProLong	Invitrogen	P36931	Milieu de montage avec DAPI
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74903
Dodécylsulfate de sodium	Sigma	71725
Sachet de stérilisation	VWR	11213-035
Robinets (unidirectionnel)	Medex	MX5061L
Seringue (10 ml)	BD	309604	Luer-lock pointe
Seringue (5 ml)	BD	309603	Luer-lock pointe
Bleu de Trypan	Invitrogen	T10282
VP5 anticorps	Santa Cruz	sc-13525	HSV-2 Clone anticorps 6F10; utilisé à 1:5000 dilution