L'avidité d'un dépistage interaction extracellulaire (AVEXIS) pour la détection évolutive de faible affinité extracellulaires interactions récepteur-ligand

Résumé

AVEXIS est un dosage à haut débit de protéines d'interaction mis au point pour l'écran systématiquement pour de nouveaux extracellulaires récepteur-ligand paires impliquées dans les processus de reconnaissance cellulaire. Il est spécialement conçu pour détecter les interactions entre protéines transitoires qui sont difficiles à identifier à l'aide d'autres approches à haut débit.

Résumé

Protéine extracellulaire: les interactions entre protéines sécrétées ou de la membrane entre-captifs protéines sont essentielles à la fois pour la cohésion initier la communication intercellulaire et d'assurer au sein d'organismes multicellulaires. Protéines prédit pour former des interactions extracellulaires sont codées par environ un quart des gènes de l'homme ^1, mais en dépit de leur importance et de l'abondance, la majorité de ces protéines ont pas documentée partenaire de liaison. Principalement, cela est dû à leur indocilité biochimique: les protéines membranaires intégrées sont difficiles à solubiliser dans leur conformation native et contiennent structurellement importantes modifications post-traductionnelles. En outre, les affinités d'interaction entre les protéines réceptrices sont souvent caractérisés par les forces d'interaction extrêmement faibles (demi-vie <1 seconde) excluant leur détection avec de nombreux couramment utilisés méthodes à haut débit ^2.

Ici, nous décrivons un essai, AVEXIS (avidité basée sur EXtracelluLAR Interaction écran) qui permet de surmonter ces défis techniques permettant la détection des interactions protéine-protéine très faibles (t _1/2 ≤ 0,1 sec) avec un faible taux de faux positifs ^3. Le dosage est généralement mis en œuvre dans un format à haut débit afin de permettre le dépistage systématique de plusieurs milliers d'interactions dans un format microplaque pratique (Fig. 1). Elle s'appuie sur la production de protéines recombinantes solubles bibliothèques qui contiennent des fragments ectodomaine de récepteurs de surface cellulaire ou des protéines sécrétées dans lequel pour dépister les interactions et, par conséquent, cette approche est appropriée pour le type I, type II, liées au GPI récepteurs de surface cellulaire et sécrétées protéines, mais pas pour des protéines membranaires multipasses tels que les canaux ioniques ou des transporteurs.

Les bibliothèques de protéines recombinantes sont produites en utilisant un système d'expression pratique et de haut niveau chez les mammifères ^4, pour s'assurer que les modifications post-traductionnelles importantes telles que glycosylation et obligations disulfure sont ajoutés. Exprimées protéines recombinantes sont sécrétées dans le milieu et produit sous deux formes: un appât biotinylé qui peut être capturée sur une phase solide revêtue de streptavidine appropriée pour le dépistage, et une enzyme-étiqueté pentamerised (β-lactamase) proie. Le protéines appâts et proies sont présentés les uns aux autres dans un mode binaire pour détecter les interactions directes entre eux, semblables à un ELISA classique (Fig. 1). Le pentamerisation des protéines dans la proie est assurée par une séquence peptidique de la protéine de la matrice du cartilage oligomérique (COMP) et augmente la concentration locale des ectodomaines fournissant ainsi des gains significatifs avidité pour permettre des interactions, même très transitoires pour être détecté. En normalisant les activités de l 'appât et en proie à des niveaux prédéterminés avant le dépistage, nous avons montré que les interactions ayant monomères demi-vies de 0,1 sec peuvent être détectés avec de faibles taux de faux positifs ^3.

Protocole

1. Compilation d'une bibliothèque de appâts et proies plasmide-vecteurs d'expression

1. Dresser une liste de récepteur de surface cellulaire et des protéines sécrétées d'intérêt à être dépistées pour des interactions et de récupérer leurs séquences à partir d'une base de données de séquences protéiques approprié. La plupart des protéines contenant un peptide N-terminal signal de sécrétion sont approprié (il s'agit notamment de type I, de GPI-liés et des protéines sécrétées). En règle générale, une famille de protéines (superfamille des immunoglobulines, par exemple ou tous les récepteurs limitées à un type de cellule spécifique, comme l'érythrocyte) seraient choisis.
2. Déterminer l'étendue des régions extracellulaires en identifiant l'emplacement du peptide signal et la région transmembranaire en utilisant un logiciel de prédiction des protéines fonctionnalité. Nous utilisons généralement ⁵ v3.0 SignalP et TMHMM v2.0 ^6.
3. Jeux d'amorces qui amplifient la conception du fragment ectodomaine entier pour chaque récepteur. Nous avons une suite de vecteurs appât et proie qui se prêtent à cet effet et qui sont unvailable de Addgene ( http://www.addgene.org/~~V ). Concevoir l'amorce sens autour de la méthionine de départ pour inclure un site NotI enzyme de restriction et une séquence Kozak optimale, ce qui est suivi par 25 paires de bases de résultat exact spécifique du gène de séquence (fig. 2A).
4. Concevoir l'amorce antisens pour tronquer protéines des récepteurs de type I, juste avant la région transmembranaire prédite de manière à exprimer l'ectodomaine entier comme une protéine recombinante soluble. Inclure un site de restriction Ascl dans cette amorce qui devrait alors se traduire dans le cadre à un rat C-terminale Cd4d3 4 tag protéines ⁷ (Fig. 2A).
5. Amplifier les fragments ectodomaine de tous les gènes en utilisant ces amorces et les cloner dans le vecteur appât ou proie. Nous avons parfois utile de commencer par les cloner dans des vecteurs navettes avant le sous-clonage dans un vecteur d'expression de mammifère appropriée, nous utilisons un dérivé du vecteur pTT3 ^3,4. Les deux l'appât et vecteurs proies CONTAIbalises n protéine C-terminal, comme suit (Fig. 2B).
   1. Appâts: un mot-clé contenant des domaines 3 et 4 de CD4 de rat (Cd4d3 4) suivie d'une protéine de séquence peptidique qui est un substrat pour l'enzyme de E. coli BirA et peut donc être monobiotinylé sur un résidu lysine spécifique (fig. 2B) . Le Cd4d3 4 tag est reconnu par l'anticorps monoclonal OX68 et est utilisé pour quantifier l'expression des protéines appâts par ELISA. Les protéines appâts sont donc monomère et monobiotinylé. Supplémentaires vecteurs protéine appât où le peptide biotinylatable est remplacée par une étiquette 6-son pour la purification sont disponibles.
   2. Proies: Les proies également contenir un rat Cd4d3 4 balise suivie d'une séquence peptidique de la protéine de rat matrice cartilagineuse oligomère (COMP) et une extrémité C-terminale β-lactamase enzymatique. Le peptide COMP assure les formes proies pentamères fois exprimé (Fig. 2B).

2. Prey et Bait-expression de la protéine

Nous utilisonsun système d'expression commode de haut niveau en utilisant la culture en suspension de la lignée cellulaire HEK293E ⁴ pour produire nos bibliothèques de protéines, mais tout système d'expression mammifère doit être adapté. Une alternative disponible dans le commerce est le système de Freestyle. Les cellules sont cultivées en routine sur une plate-forme de secousses (125 rpm) à 37 ° C, 5% de CO ₂ à une humidité relative de 70%. Protéines de contrôle à la fois positifs et négatifs doivent également être exprimé. Le rat Cd4d3 4 tag seule fragment est disponible à la fois comme un appât et proie et sont appropriés les contrôles négatifs. De même, les vecteurs appâts et proies qui codent pour un contrôle positif sont disponibles (Addgene); nous utilisons généralement le rat CD200-CD200R interaction ^8.

1. Semences des cellules HEK293E le jour avant la transfection à une densité de 2,5 x 10 ⁵ cellules mL ^-1. Nous avons régulièrement la culture des cellules dans des volumes de 50 mL dans Freestyle293 médias à la suite des recommandations du fabricant. Afin d'assurer la biotinylation efficace, complètent til milieu de culture cellulaire utilisé pour produire des protéines avec des appâts D-biotine à une concentration finale de 100 pM. Moyen utilisé pour exprimer les protéines des proies n'a pas besoin d'être complétée par plus de la D-biotine.
2. Le lendemain, les cellules en utilisant transfecter un réactif approprié transfections (293fectin par exemple). Utilisation 25 pg de l'appât ou proies constructions de plasmide pour transfecter une culture de 50 ml. Pour produire des appâts biotinylés, co-transfecter le plasmide codant l'amorce construire un plasmide qui code pour une forme sécrétée de la protéine E. coli-biotine-ligase ( BirA) qui est disponible à partir Addgene. Plasmides appât Co-transfecter à un ratio de 10:1 (2,5 ug) de l'plasmide codant pour la protéine sécrétée Bira.
3. Cultures récolte cinq jours post-transfection en trouvant d'abord la granulation des cellules par centrifugation à 3000 x g pendant 20 minutes, suivie par filtration du surnageant à travers un filtre de 0,22 uM.

[Conseil: Bait and protéine proies doivent être stockés non dilué à 4 ° C et en tant que directrice générale doit être utilisé dans un an. Ajouter bactériostatiques tels que 50 pg / ml de sulfate de polymyxine B ou 10 mM NaN ₃ à prévenir la contamination bactérienne des surnageants.]

3. Normalisation de l'appât et échantillons Prey

Une des principales caractéristiques de l'essai AVEXIS est que parce que les protéines recombinantes sont sécrétées ils peuvent être diluée ou concentrée (normalisé) à l'intérieur des activités de seuil établies avant d'être utilisé dans le dosage. Nous avons constaté que les niveaux auxquels les protéines recombinantes sont exprimées couvrent un large éventail - jusqu'à 4 ordres de grandeur - et ainsi l'étape de normalisation réduit considérablement le nombre de faux positifs au cours des écrans.

3,1 normalisation Bait

Remarque: non conjugué D-biotine doivent être retirés dans les médias (généralement par dialyse), car il sera en concurrence avec l'biotinylé baiprotéines t pour la liaison à la streptavidine sites de liaison.

1. Transfert surnageants d'appât dans un tube de dialyse, l'étiquette, clip en toute sécurité et dialyse extensive contre un tampon approprié tel que du PBS pour éliminer la biotine libre.

[Astuce: Nous avons trouvé que la dialyse est normalement suffisante pour atteindre 6 x 50 mL surnageants appâts contre un volume de 4,5 L de PBS avec 4 changements sur une période de 24 heures. Dialyse insuffisante peut être observé par une inhibition de la protéine de liaison à des dilutions basses lors de l'étape de normalisation appâts (figure 3A).

2. Effectuer un test ELISA pour déterminer les niveaux relatifs au cours de laquelle les protéines appâts sont exprimées. Préparer une série de dilution des protéines appâts biotinylés et de les capturer sur une plaque de microtitrage revêtue de streptavidine. Utilisez le rat Cd4d3 4 tag pour détecter et quantifier les protéines appâts capturés à l'aide d'un anticorps monoclonal (OX68). Concentrer ou diluer les protéines appâts à la quantité minimale nécessaire pour saturer tous les biotdans des sites de liaison dans le puits d'une plaque revêtue de streptavidine.
3. Bloquer les puits d'une plaque recouverte de streptavidine avec un tampon phosphate saline/0.1% de Tween-20 (PBST) / 2% de sérumalbumine bovine (BSA) pendant 15 minutes.
4. Dans une plaque séparée, faire une série de dilution (quatre dilutions 1:3 sont généralement suffisantes) des protéines appâts dans BSA PBST / 2% et le transfert à des puits d'une plaque recouverte de streptavidine. Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
5. Laver 3x dans le PBST. Ajouter 100 ul de 2 pg / ml de souris anti-rat Cd4d3 4 IgG (OX68) incuber pendant 1 heure à température ambiante.
6. Laver 3x dans le PBST. Ajouter 100 ul d'anticorps anti-souris phosphatase alcaline au 1:5.000 dilution dans PBST / 2% de BSA et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
7. Laver 3x en PBST et effectuer un lavage final dans du PBS pour éliminer tout résidu de détergent. Ajouter 100 pi de 1 mg / ml de substrat 104 en tampon diéthanolamine (diéthanolamine à 10% (v / v), 0,5 mM MgCl _2, 10 mM NaN _3, pH9.8, stocké à l'abri de la lumière à 4° C).
8. Après une heure, mesurer l'absorbance à 405 nm. Les résultats représentatifs sont présentés appâts de normalisation sur la figure 3A.
9. Protéines appâts qui sont exprimés à des niveaux qui sont insuffisants pour saturer tous les sites de liaison de biotine d'une plaque recouverte de streptavidine, lorsqu'il est utilisé non dilué, devrait être concentrée à l'aide Vivaspin concentrateurs (Vivascience, 10 kDa MWCO). Comme un guide, nous estimons que ~ 5 ug d'une protéine appât typique (~ 80 kDa) est suffisante pour saturer une plaque à 96 puits.
   1. Protéines exprimées Bait à des niveaux élevés peut être dilué dans BSA PBST / 2% à une concentration suffisante pour saturer la plaque recouverte de streptavidine. L'activité des appâts doivent être revérifié après dilution ou de concentration afin de s'assurer qu'ils saturer tous les sites de liaison à la biotine dans la plaque recouverte de streptavidine.

3,2 normalisation Prey

1. Quantifier les niveaux relatifs au cours de laquelle les protéines proies sont exprimés en utilisant le β-lactamasel'activité enzymatique.
2. Tout d'abord, faire une série de dilution du surnageant contenant les protéines des proies dans PBST / 2% de tampon BSA. Puis ajouter 20 ul des dilutions à 60 242 pi d'une uM (0,125 mg / mL) nitrocéfine solution (Calbiochem).
3. Transférer immédiatement la plaque d'un lecteur de microplaque qui prend une mesure d'absorbance à 485 nm toutes les minutes pendant 20 minutes à température ambiante. Les résultats représentatifs sont présentés proies de normalisation sur la figure 3B.
4. Concentrez-échantillons à l'aide concentrateurs centrifuges ou les diluer dans du PBST BSA / 2% pour atteindre un seuil de l'activité ~ 2 nmol min ^-1 chiffre d'affaires de nitrocéfine. Pratiquement, ceci est réalisé si tous les nitrocéfine est hydrolysé dans ~ 7 minutes.

4. Procédure de dépistage AVEXIS

1. Laver une plaque recouverte de streptavidine dans du PBST.
2. Ajouter 100 ul de BSA PBST / 2% à chaque puits et incuber pendant 30 minutes pour bloquer tous les sites de liaison de protéines parasites dans chaque puits.

[Astuce: pour enlever toute solution de lavage résiduelle après les étapes de lavage, la plaque est taraudé - vigoureusement - sur du papier absorbant]

3. Retirer la solution de blocage avec une chiquenaude à puce de la plaque de dessus d'un évier et ajouter 100 ul normalisée appâts biotinylé monomère dans les puits appropriés et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
4. Retirer les échantillons d'appâts de la plaque par retournement de la plaque et intelligemment pichenette dessus d'un évier, et laver 3 fois dans du PBST.
5. Ajouter 100 ul de la proie normalisée pentamerized construire à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 1 heure, laver comme à l'étape 4.4 et effectuer un lavage final avec PBS.
6. Ajouter 60 uL de 242 uM nitrocéfine solution (Dissolvez 5 mg de nitrocéfine dans 500 ul de DMSO, bien mélanger puis diluer le nitrocéfine dans 40 ml de PBS et de passer à travers un filtre de 0,22 um avant d'ajouter sur les plaques) et incuber à température ambiante . Les interactions positives peuvent être observéesà l'œil nu depuis la nitrocéfine jaune est hydrolysé en une couleur rouge. Quantifier par la lecture de l'absorbance à 485 nm en utilisant un lecteur de plaque. Une plaque type et la quantification est représentée dans la Fig. 4.

[Astuce: Les interactions positives sont habituellement observées dans les 2 heures à température ambiante, bien que les plaques doivent être placés à 4 ° C pendant 16 heures pour s'assurer que toutes les interactions potentielles sont détectées. Nous avons également constaté que nitrocéfine précipitée et imperfections sur le plastique de la plaque de microtitration comme des rayures ou des empreintes digitales peut parfois conduire à des faux positifs artefactuelles à 485 nm, malgré l'absence d'hydrolyse nitrocéfine manifeste. Il est donc conseillé de prendre des photographies des plaques visuellement chiffre d'affaires record nitrocéfine dans le puits.]

5. Les résultats représentatifs

Un exemple d'une plaque de dépistage AVEXIS représentant est montré dans la figure 4. On devrait observer l'hydrolyse (jaune à rouge) du substrat nitrocéfine dans lecontrôle positif puits (à la fois le médiée par les anticorps de contrôle et de capture des proies aussi l'interaction de contrôle positif) dans une dizaine de minutes. Certaines interactions au sein de l'écran sont également observées au sein de cette échelle de temps, mais d'autres peuvent prendre plus de temps (quelques heures) à comparaître. En règle générale, un taux de succès d'environ 0,4-0,6% (une interaction positive pour tous les 150-250 interactions étant projetés) est typique, selon les banques de protéines étant projetés.


Figure 1. Identification des interactions récepteur-ligand de médiation des processus de reconnaissance cellulaire en utilisant AVEXIS. Le schéma montre deux cellules en interaction (A et B) qui échangent des informations grâce à des interactions entre les protéines apportées récepteur membranaire-intégrées. AVEXIS est un dosage de protéine d'interaction s'adaptent spécifiquement conçu pour identifier de nouvelles récepteur-ligand paires qui sont caractérisés par les forces d'interaction très faibles. Recombinant afinbibliothèques de protéines luble représentant l'ectodomaine ensemble du répertoire de récepteur de surface cellulaire des deux cellules sont compilées, soit en tant que proies pentamériques β-lactamase-marqués (type de cellule A) ou monomères appâts biotine-étiquetés (pour B type de cellule). Le pentamerisation des proies augmente la concentration locale des ectodomaines pour effectuer un gain global avidité afin que les interactions, même très transitoires peuvent être détectés. La bibliothèque est un appât disposées sur des plaques recouvertes de streptavidine et systématiquement sondé pour les interactions avec les protéines des proies. Après un bref lavage, les proies capturées sont détectés en utilisant l'activité β-lactamase associée à la proie.


Figure 2. Appât et de la conception construction proie. (A) La protéine récepteur CD200 rat est fourni à titre d'exemple de la façon dont les ectodomaines entières de protéines récepteurs de surface cellulaire sont déterminées et les amorces sont conçues pour rendre à la fois l'appâtet des constructions d'expression proies. La séquence d'ADNc de protéine et traduit sont représentés du peptide signal N-terminale à la membrane d'écartement de région transmembranaire de rat CD200. Une amorce sens est conçu pour inclure un site 5 'enzyme de restriction Notl et la séquence Kozak optimale suivie par 25 bases de la séquence de correspondance exacte à la séquence d'ADNc CD200. L'amorce antisens comprend un site Ascl et 25 bases de la séquence résultat exact situé immédiatement en amont du résidu troncature ectodomaine sélectionné. Pour garder l'ectodomaine dans le cadre avec le rat Cd4d3 4 tag, le site devrait se traduire par Ascl que Gly-Ala-Pro. (B) Les représentations schématiques de l'appât et des constructions d'expression proies. Chacun contient des récepteurs ectodomaines flanqués de Notl et sites Ascl et un Cd4d3 4 tag. Les appâts contiennent une séquence peptide C-terminal qui peut être spécifiquement monobiotinylé par co-transfection avec un plasmide exprimant une enzyme sécrétée BirA. Les proies sont suivis par la séquence pentamerisationde la protéine de matrice du cartilage oligomère (COMP) et de l'enzyme β-lactamase.


Figure 3. La normalisation de la protéines appâts et proies. (A) Des exemples représentatifs de la normalisation appât. Une série de dilution de quatre différents surnageants appâts dialysés ont été détectés par ELISA en utilisant un anticorps anti-CD4 tag monoclonal. Les quatre appâts sont exprimés à différents niveaux 1> 2> 3> 4. Les appâts doivent être normalisées à un niveau de seuil qui sature les sites de liaison de biotine dans chaque puits. Appâts hautement exprimées peuvent être dilués pour conserver la protéine (par exemple l'appât 1 pourrait être dilué ~ 1:100), et les appâts mal exprimées concentré. Lectures a diminué à basses dilutions sont parfois observés dans certains appâts (appâts par exemple 2), qui est attribuable à la présence de D-biotine non conjuguée due à la dialyse incomplète. (B) Les niveaux auxquels s'attaquent les protéines sont expressé est quantifiée en utilisant le taux d'hydrolyse d'un substrat β-lactamase, nitrocéfine. Dans l'exemple illustré, les trois proies sont exprimés à différents niveaux: la proie 1> 2> 3. Proies doit être étalonnée par rapport à une activité de ~ 2 ^-1 nmol min, qui correspond à compléter l'hydrolyse de 14,5 nmoles nitrocéfine dans ~ 7 minutes (par exemple proies 1). Les proies d'autres dans cet exemple devrait être concentré avant de l'utiliser dans le dépistage.


Figure 4. Les résultats représentatifs de dépistage AVEXIS. (A) Une photographie d'une plaque de dépistage AVEXIS représentant. Une protéine proie est sondé contre 41 types d'appâts et une interaction positive est détectée dans E2 ainsi. Commandes utilisées dans les plaques de blindage comprennent: un biotinylé anticorps anti-CD4 pour capturer toutes les protéines des proies ajouté dans le puits (G6), une interaction de contrôle: le rat CD200 (appât)-CD200R (proie) avec le CD200R proie utilisé à une dilution seuil de (H3), 1:10 (H4) et 1:100 (H5). Les contrôles négatifs étaient: un Cd4d3 4 appâts sondé avec la protéine proie étant projeté (H1) et la proie CD200R (H2). (B) Quantification des valeurs d'absorbance de l'écran même réalisé en triple. Les points de données sont des moyennes ± écart-type.

Discussion

Lorsque les cellules vivantes sont observées in vivo, leurs membranes plasmiques présentent des comportements très dynamiques: l'extension et de rétraction des procédés membranaires comme ils entrent en contact et communiquer avec leurs ² voisins. Les interactions physiques entre les protéines réceptrices membrane embarqués qui interviennent dans beaucoup de ces contacts ont évolué pour être extrêmement faible afin de permettre ce comportement très mobiles. Il a été estimé que les forces d'interaction monomères aussi faibles que 50 uM pourrait être suffisante pour entraîner des interactions spontanées à des densités de récepteurs physiologiques ⁹ ce qui rend la détection de nouvelles interactions extrêmement difficiles ^2,10. La méthode décrite ici AVEXIS fournit une méthode sensible pour détecter transitoire protéine extracellulaire: les interactions entre protéines qui peuvent être mises en œuvre d'une manière évolutive avec un faible taux de faux positifs. Alors que d'autres méthodes évolutives ont été développés pour détecter les interactions extracellulaires ^11-15,un avantage de AVEXIS est que les paramètres expérimentaux tels que l'appât et les activités de proies ont été quantifiés pour détecter même les plus faibles des interactions (t _1/2 ≤ 0,1 s) tout en conservant un faible taux de faux positifs ^3. En outre, les procédures simplifiées et robuste de préparation des échantillons ont permis ce test à mettre en œuvre à une échelle beaucoup plus grande que d'autres essais et nous avons récemment décrit un écran interaction systématique totalisant plus de ~ 16.500 interactions potentielles ^16.

Le dosage peut être effectué sur toute protéine pour laquelle il est possible d'exprimer un fragment de protéine recombinante soluble. Cela comprend donc protéines qui contiennent un peptide signal N-terminale telle que le type I, GPI-liés et des protéines sécrétées. Nous avons récemment conçu une suite de vecteurs qui permettent aujourd'hui d'exprimer les protéines de type II comme appâts ^17. Le test n'est généralement pas adapté pour des protéines membranaires multipasses comme transporteur ioniques ou des pompes, car ils ont peu de chances d'être correctement pliée en dehors du contexte d'une membrane plasmique. Nous avons appliqué cette méthode à une variété de systèmes différents et ont exprimé avec succès des protéines extracellulaires de poisson-zèbre ^3,16,18, humain, souris et P. falciparum pour les écrans d'interaction.

En ce qui concerne les ressources nécessaires pour mettre en place un écran AVEXIS, nous avons constaté que un goulot d'étranglement important est la sélection, la construction, et le séquençage complet des plasmides d'expression. Cet aspect de la méthode peut prendre jusqu'à un an pour faire ~ 100 appâts et les constructions proies, mais, avec la baisse du coût de la synthèse de gènes, nous avons maintenant favoriser le commerce sous-traitance cet aspect du projet. Le système d'expression mammifère avec un grand secouant incubateur de culture tissulaire (nous utilisons un INFORS HT Multitron Cell) permet à un seul chercheur à exprimer et à normaliser jusqu'à ~ 100 protéines appâts et proies d'un mois. Une fois que les protéines sont produites et normalisées, screening d'interactions est rapide avec un maximum à douze plaques à 96 puits étant commodément traitées par jour. Le seul équipement sur mesure que nous avons mis au point pour faciliter la production d'un tel grand nombre de protéines est un air comprimé à pistons entraînés qui est utilisé pour transmettre un maximum de cinq surnageants à travers un filtre 0.22μm en parallèle.

La classe principale des interactions qui pourraient être manquées par rapport aux interactions attendues de la littérature (faux négatifs) sont des interactions homophiles, même si certaines de ces interactions peuvent être détectés ^3. Dans les cas où les interactions attendues ne sont pas détectées, nous croyons que cela est dû à la formation des interactions homophiles par les protéines des proies (une proie "masquage" effet) ce qui l'empêche de nouvelles interactions avec des protéines appâts immobilisés. La fréquence à laquelle les interactions sont détectées dépend du contenu de la bibliothèque protéine étant projeté. Comme un guide pour le lecteur, un écran de> 30, 000 interactions au sein de la superfamille des immunoglobulines poisson zèbre abouti à 188 résultats positifs - une fréquence de 0,6% ^3,16,18. Un chèque très rapide qui peut être effectuée pour vérifier les résultats positifs est de déterminer si l'interaction peut être détecté dans les deux appât-proie orientations; qui est, peut être la même interaction détectée indépendamment du fait que les protéines de liaison sont présents sous forme soit d'un appât ou une proie. Chaque fois que nous avons observé ce comportement alternatif, la liaison a ensuite été montré pour être précis, en démontrant la liaison directe saturable de protéines purifiées en utilisant résonance plasmonique de surface. Il convient de souligner que, parce que nous augmentons avidité de liaison par les protéines artificiellement pentamerising proies, nous ne considérons pas le dosage approprié pour comparer quantitativement les forces d'interaction. Pour obtenir biophysiques paramètres de liaison d'interactions que nous utilisons protéines monomériques et résonance plasmonique de surface. Enfin, une fois une interaction a été identifiée, le salutnature débit gh de l'essai, il est relativement facile d'adapter le dosage à l'écran pour les réactifs tels que des anticorps ou des petites molécules qui bloquent l'interaction.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom de réactif	Entreprise	Cat. Nombre	Commentaires
Freestyle médias	Invitrogen	12338018
Nitrocéfine	Calbiochem	484400
Des plaques de microtitrage SA-revêtues	Nunc	734-1284
OX68 anticorps	AbDSerotec	MCA1022R
Un tube de dialyse	Percer	PN68100
Polymyxine B	Sigma	P4932
D-biotine	Sigma	B4639-5G
Substrat-104	Sigma	1040-506
Vivaspin-20 concentrateurs centrifuges	Sartorius	VS2002
Des filtres de 0,22 um	Nalgene	190-2520