Dans cet article, nous décrivons une méthode utilisant multi-spectrale cytométrie de flux d'imagerie pour quantifier l'internalisation des nanoparticules ou des bactéries polyanhydride par des cellules RAW 264.7.
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Article de méthode
Analyser l'internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d'imagerie
Dans cet article
Résumé
Résumé
Systèmes Nanoparticulate ont émergé comme des outils précieux dans la livraison des vaccins par leur capacité à fournir efficacement des marchandises, y compris les protéines, les cellules présentatrices d'antigènes 1-5. L'internalisation des nanoparticules (NP) par les cellules présentatrices de l'antigène est une étape cruciale pour générer une réponse immunitaire efficace à l'antigène encapsulé. Pour déterminer comment les changements dans la fonction incidence des nanoparticules formulation, nous avons cherché à développer un débit élevé, quantitative protocole expérimental qui était compatible avec la détection des nanoparticules internalisées ainsi que les bactéries. À ce jour, deux techniques indépendantes, la microscopie et cytométrie de flux, ont été les méthodes utilisées pour étudier la phagocytose des nanoparticules. La nature à haut débit de la cytométrie de flux génère données statistiques solides. Toutefois, en raison de faible résolution, il ne parvient pas à quantifier avec précision par rapport à des cellules internalisées nanoparticules liées. Microscopie génère des images à haute résolution spatiale; houtefois, cela prend du temps et implique de petits échantillons 6-8. Multi-spectrale cytométrie de flux d'imagerie (MIFC) est une nouvelle technologie qui intègre les aspects de la microscopie et cytométrie en flux qui effectue multicolore imagerie spectrale de fluorescence champ et lumineux à la fois à travers un noyau laminaire. Cette capacité fournit une analyse précise des intensités de signaux fluorescents et les relations spatiales entre les différentes structures et fonctions cellulaires à haute vitesse.
Nous décrivons ici une méthode utilisant MIFC pour caractériser les populations de cellules qui ont intériorisé des nanoparticules polyanhydrides ou Salmonella enterica sérotype Typhimurium. Nous décrivons également la préparation de suspensions de nanoparticules, l'étiquetage, l'acquisition de la cellule sur un système ImageStream X et l'analyse des données en utilisant l'application IDÉES. Nous démontrons également l'application d'une technique qui peut être utilisé pour différencier l'internalisation pathways pour nanoparticules et les bactéries à l'aide cytochalasine-D comme inhibiteur de l'actine-phagocytose.
Protocole
1. RAW 264.7 de la culture cellulaire
- Récolte des cellules RAW 264.7 de leurs flacons quand ils atteignent la confluence en les grattant délicatement avec un grattoir à cellules. Le comte et la plaque eux dans un plat de 24 puits de culture cellulaire à une densité de 5 x 10 5 cellules / puits dans 0,5 ml de milieu complet Eagle modifié par Dulbecco (cDMEM; 10% inactivé par la chaleur du sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM Glutamax, et 10 mM d'HEPES) et incuber une nuit à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur.
2. Salmonella enterica sérotype Typhimurium pathogène 14028 Transformation et de la Cul....
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Discussion
Des études ont montré que les nanoparticules biodégradables à base de poly (lactique-co-acide glycolique (PLGA) ou polyanhydrides peuvent être utilisés pour délivrer des antigènes encapsulés ou des médicaments à des cellules cibles. L'adoption de ces nanoparticules par les cellules phagocytaires est important pour leur efficacité, ce qui rend quantitative . analyse de l'internalisation crucial dans la conception de nouveaux systèmes de nanoparticules de livraison En utilisant cette méthode, l'absorption diff.......
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Déclarations de divulgation
Sherree L. ami est employé par Amnis Corporation, qui fabrique le système X ImageStream.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le Prix ONR-Muri (NN00014-06-1-1176) et le US Army Medical Research et du matériel de commande (Numéros de subvention W81XWH-09-1-0386 et W81XWH-10-1-0806) pour les financiers soutenir.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| RAW 264.7 lignée cellulaire | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Sérum de veau fœtal | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24 et la plaque | PPT | 92024 | |
| Flacons de culture cellulaire | PPT | 90151 | |
| Racloir à cellules | PPT | 99002 | 24 cm |
| Salmonella enterica sérotype Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Manipulateur cellule électro | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Tampon phosphate salin (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasons processeur liquide | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasine-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldéhyde | Polysciences | 04018 | |
| Le tampon de lavage | FBS 2% de la chaleur inactivé, l'azoture de sodium à 0,1% dans du PBS. | ||
| Perm / tampon de lavage | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-voir microtubes Snap Cap | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor 660 phalloïdine | Invitrogen | A22285 | |
| X ImageStream | Amnis Corporationtion | 100200 | Options: 658nm laser, passeur d'échantillons |
| L'azoture de sodium | Fisher Scientific | S-500 227I |
Références
- Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642(2011).
- Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jac....
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Cytométrie en flux d'imagerie multispectraleinternalisation de nanoparticulesphagocytose bactérienneinternalisation dépendante de l'actineinhibition par la cytochalasine-Dsystème ImageStreamXlogiciel d'analyse IDEASintensité du signal fluorescentanalyse de la résolution spatialequantification des caractéristiques d'internalisation
