Caryotype spectral pour l'étude d'anomalies chromosomiques dans les humains et les souris de la maladie polykystique des reins

Résumé

Caryotype spectral (SKY) est une technique avancée cytogénétique à identifier aberrations génomiques et chromosomiques. Cette technique tire avantage des sondes de peinture chromosomique, ce qui permet la classification de tous les chromosomes. SKY peut également identifier des aberrations chromosomiques complexes et les défauts d'isolement chez les souris et les humains atteints de diverses maladies, y compris la maladie polykystique des reins.

Résumé

Méthode conventionnelle pour identifier et classer des chromosomes individuels dépend de la configuration unique des bandes de chaque chromosome dans une espèce spécifique en cours d'analyse ^{1, 2.} Cette technique classique de baguage, cependant, n'est pas fiable dans l'identification des aberrations chromosomiques complexes tels que ceux associés au cancer. Pour surmonter les limites de la technique de baguage, caryotype spectral (SKY) est introduite pour fournir beaucoup d'informations fiables sur les anomalies chromosomiques.

SKY est une fluorescence multicolore hybridation in situ (FISH) technique pour détecter les chromosomes en métaphase avec un microscope spectrale ^{3, 4.} SKY a été prouvé être un outil précieux pour l'analyse cytogénétique d'un large éventail d'anomalies chromosomiques associées à un grand nombre de maladies génétiques et les tumeurs malignes ^{5, 6.} SKY implique l'utilisation de sondes multicolores d'ADN par fluorescence-labellisés préparés à partir de l'oligonucle dégénéréeamorces otide par PCR. Ainsi, chaque chromosome a une couleur spectrale unique après dans-in situ hybridation avec des sondes, qui sont marquées de façon différentielle avec un mélange de colorants fluorescents (rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC et Cy5.5). Les sondes utilisées pour SKY comporter jusqu'à 55 sondes chromosomiques spécifiques ^7-10.

La procédure pour SKY comporte plusieurs étapes (Figure 1). SKY nécessite la disponibilité de cellules avec index mitotique élevé à partir de tissu normal ou malade ou de sang. Les chromosomes d'une cellule unique à partir d'une cellule fraîchement isolés primaire ou une lignée cellulaire sont étalées sur une lame de verre. Cette propagation chromosome est marqué avec une combinaison différente de colorants fluorescents spécifiques pour chaque chromosome. Pour sonde de détection et d'acquisition d'image, le système d'imagerie spectrale se compose de l'interféromètre de Sagnac et une caméra CCD. Ceci permet de mesurer le spectre de la lumière visible émise par l'échantillon et d'acquérir une image spectrale vientchromosomes m individuels. HiSKY, le logiciel utilisé pour analyser les résultats des images capturées, fournit une identification facile des anomalies chromosomiques. Le résultat final est une métaphase et une image de classification caryotype, dans lequel chaque paire de chromosomes a une couleur distincte (figure 2). Cela permet une identification facile des identités et des translocations chromosomiques. Pour plus de détails, s'il vous plaît visitez le site Web Applied Spectral Imaging ( http://www.spectral-imaging.com/ ).

SKY a été récemment utilisé pour l'identification des défauts de ségrégation des chromosomes et des anomalies chromosomiques chez l'homme et la souris avec rénale autosomique dominante polykystique (PKRAD), une maladie génétique caractérisée par un dysfonctionnement dans les cils primaires ^11-13. En utilisant cette technique, nous avons démontré la présence de la ségrégation des chromosomes anormaux et anomalies chromosomiques chez les patients PKRAD et des modèles de souris ¹⁴. Des analyses plus poussées en utilisant SKY non seulement nous a permis d'identifier nombre chromosomique et de l'identité, mais aussi de détecter avec précision très complexes aberrations chromosomiques telles que des délétions chromosomiques et des translocations (figure 2).

Protocole

1. Prétraitement des cellules et la préparation métaphase

1. Les cellules sont cultivées dans la modification de Dulbecco du milieu de Eagle (DMEM) contenant 10-15% de sérum bovin foetal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine à 37 ° C avec 5% de CO ₂ incubateur, jusqu'à ce qu'ils atteignent 70-80% de confluence.
2. Traiter les cellules avec une solution colcémide à 0,05 pg / ml pendant 30-60 min.
3. Recueillir le milieu contenant des cellules flottantes dans des tubes stériles de 50 ml à centrifuger faucon. Rincer les cellules sur la plaque avec sterile1X-PBS. Après une incubation avec de la trypsine stérile pendant 1-2 mi....

Discussion

Caryotype spectral (SKY) est une technique utilisée dans l'étude cytogénétique des compositions génomiques et chromosomiques. Cette technique tire avantage des sondes de peinture chromosomique, et la détection de ces sondes sont acquis par un interféromètre de Sagnac. Le processus complet SKY prend habituellement environ une semaine, et il comporte plusieurs étapes clés (figure 1). Le SKY utilise un protocole standard, qui a d'abord été décrit par Padilla Nash et al ^3. Le pro.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Le numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Cellgro Mediatech Inc	10-013-CV
Sérum de veau fœtal (FBS)	Hyclone	SH30088-03
Penecillin / streptomycine	Thermo Scientific	SV30010
Colcemid	Roche Diagnostics	10 295 892 001	10 pg / ml
HCl	Fisher Scientific	A144-500
KCl	Fisher Scientific	S77375-1
Phosphate de solution saline tamponnée au	Thermo Scientific	SH30256-01
SKY peinture sonde kit (Human)	Applied Spectral Imaging	SKY000028
SKY peinture sonde kit (souris)	Applied Spectral Imaging	SKY000030
Concentré kit de détection des anticorps	Applied Spectral Imaging	SKY000033
Trypsine	Thermo Scientific	SH30236.01
Le méthanol	Fisher Scientific	A433P-4
L'acide acétique	Fisher Scientific	A38-212
RNase A	Roche Diagnostics	10 109 169 001
Pepsine	Sigma-Aldrich	P6887-5G
MgCl 2	Fluka	63069-500ML
Formaldéhyde 37%	Mallinckrodt Baker	2106-02
20X SSC	Promega	V4261
Le formamide	Fluka	47671	préparer juste avant utilisation
De Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Lames de verre de microscope	Fisher Scientific	12-549
Microscope couvercle en verre 24x60mm	VWR Vista Vision	16004-312
Colle de caoutchouc	Elmer (locales magasin de détail)
Hybridation / humidifiedchamber / Plateau	Simport	M920-2	mettre des serviettes en papier humide au fond
Thermocycleur	Eppendorf	Epgradient S
Secouant la plate-forme / Agitateur orbital	Bellco biotechnologie
Secouant salle de bain / eau	Précision scientifique
DAPI filtre cube	Technologie Chroma
SKY filtre cube	Technologie Chroma
SpectraCube	Applied Spectral Imaging
Microscope inversé culture cellulaire	Nikon	Nikon Eclipse TS100
Microscope à fluorescence	Olympe	IX70	Huile de 60X