Une méthode étape par étape pour la reconstitution d'un transporteur ABC dans des particules lipidiques Nanodisc

Résumé

NANODISQUES sont de petites particules discoïdes qui incorporent des protéines membranaires dans un petit lopin de bicouche phospholipidique. Nous fournir un protocole visuelle montre que l'incorporation étape par étape du transporteur MalFGK2 dans un disque.

Résumé

Le nanodisc est une particule en forme de disque (~ 10-12 nm grande) que les protéines membranaires piège dans une petite parcelle de bicouche phospholipidique. Le nanodisc est une option particulièrement intéressante pour l'étude des protéines membranaires, en particulier dans le contexte de interactions ligand-récepteur. Le procédé mis au point par Sligar et ses collaborateurs est basée sur les propriétés amphipathiques d'une ingénierie très une hélice protéine extraite de l'échafaudage apolipoprotéines A1. Les faces hydrophobes de la protéine d'échafaudage interagir avec les acyles gras des chaînes latérales de la bicouche lipidique, alors que les régions polaires face à l'environnement aqueux. L'analyse des protéines membranaires ont NANODISQUES avantages significatifs par rapport liposome, car les particules sont petites, homogène et soluble dans l'eau. En outre, les méthodes biochimiques et biophysiques normalement réservés à des protéines solubles peuvent être appliqués, et de part et d'autre de la membrane. Dans ce protocole visuelle, nous présentons une reconstitution étape par étape, d'un caractère bientérisée transporteur ABC bactérien, le mâle-MalFGK complexe _2. La formation du disque est un processus d'auto-assemblage qui dépend des interactions hydrophobes qui ont lieu au cours de l'élimination progressive du détergent. Nous décrivons les étapes essentielles et nous soulignons l'importance de choisir un bon protéine-lipide rapport afin de limiter la formation d'agrégats et les grands polydisperses liposomes comme des particules. Contrôle qualité simples telles que la chromatographie de filtration sur gel, l'électrophorèse sur gel natif et dynamique spectroscopie de diffusion de lumière en sorte que les disques ont été correctement reconstitué.

Protocole

Processus de reconstitution globale

Le processus de reconstitution commence par mélanger la protéine d'échafaudage membranaire (MSP) avec le complexe purifié MalFGK ₂ en présence d'un détergent-solubilisées phospholipides. L'étape est suivie de l'élimination lente de la lessive par un matériau adsorbant en polystyrène appelé Bio-Beads ou Amberlite (figure 1). Le processus d'auto-assemblage se produit probablement en raison des interactions entre les phospholipides apolaires hydrophobes, le ₂ MalFGK complexes et la surface de la protéine MSP amphipathique. Le produit final est u....

Discussion

Nous décrivons une procédure simple pour la reconstitution du transporteur maltose en NANODISQUES. Le transporteur est ATPase active et l'interaction avec le mâle partenaire de liaison soluble peut être recréé (figure 3). La reconstitution réussie du transporteur en NANODISQUES ouvrir la voie à l'analyse biophysique et biochimique supplémentaire. D'un intérêt particulier sera l'analyse systématique de l'ATPase MalK et de l'activité de transport du maltose dans du détergent, des l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Amicon Ultra-4 50K filtre centrifuge	Millipore	UFC805008	Suivre le protocole du fabricant pour une utilisation correcte
Bio-Beads SM-2 Adsorbant	Bio-Rad	152-3920
E. coli lipides totaux	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissous dans du chloroforme, gérer comme il convient pour un solvant organique
Ni Sepharose HP résine	GE Healthcare	17-5268-01
Solution étalon de phosphore	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Tableau I. réactifs spécifiques.
			Nom Composition Commentaires DDM actions 10% v / v DDM Remettre en suspension dans l'eau milliQ et conserver à -20 ° C MalFGK 2 stock 1-2 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 NaCl 100 mM 10% v / v de glycérol 0,03% p / v DDM Conserver à -70 ° C après purification MSP actions 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 NaCl 100 mM 10% v / v de glycérol Conserver à -70 ° C après purification en aliquotes de 1 ml et <éviter de trop cycles gel / dégel Actions phospholipides 5 nM E. coli en lipides totaux 0,5% p / v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM de NaCl Conserver à 4 ° C pendant 1 semaine TS tampon 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM de NaCl Stocker à 4 ° C TSG10 tampon 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 NaCl 100 mM 10% v / v de glycérol Stocker à 4 ° C TSG20 tampon 50 mM Tris-HCl, pH8 NaCl 100 mM 20% v / v de glycérol Stocker à 4 ° C Tampon TSGD 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 NaCl 100 mM 10% v / v de glycérol 0,03% p / v DDM Conserver à 4 ° C et ajouter DDM juste avant l'utilisation Tableau II. Solution recettes.