À haut débit de cartographie physique des chromosomes à l'aide automatisée In situ Hybridation

Résumé

Les assemblages de génomes basés sur des technologies de séquençage d’ADN massivement parallèles sont généralement très fragmentés. Le développement de cartes chromosomiques physiques peut potentiellement améliorer les assemblages du génome. Ici, nous démontrons des approches innovantes de la préparation des chromosomes, de l’hybridation fluorescente in situ et de l’imagerie qui augmentent considérablement le débit de développement de la carte physique.

Résumé

Des projets visant à obtenir des séquences du génome entier pour 10 000 espèces de vertébrés¹ et pour 5 000 espèces d’insectes et d’arthropodes apparentées² devraient avoir lieu au cours des 5 prochaines années. Par exemple, le séquençage des génomes de 15 espèces de moustiques du paludisme est actuellement effectué à l’aide d’une plateforme Illumina^3,4. Ce groupe d’espèces d’anophèles comprend à la fois des vecteurs et des non-vecteurs du paludisme. Lorsque les assemblages du génome seront disponibles, les chercheurs auront l’occasion unique d’effectuer une analyse comparative pour déduire les changements évolutifs pertinents à la capacité du vecteur. Cependant, il s’est avéré difficile d’utiliser les lectures de séquençage de nouvelle génération pour générer des assemblages de génome de novo de haute qualité⁵. De plus, les assemblages génomiques existants d’Anopheles gambiae, bien qu’obtenus par la méthode de Sanger, sont écartés ou fragmentés^4,6.

Le succès des analyses génomiques comparatives sera limité si les chercheurs traitent de nombreux contigs de séquençage, plutôt que des assemblages de génomes basés sur les chromosomes. Les séquences fragmentées et non cartographiées posent des problèmes pour les analyses génomiques parce que : (i) les lacunes non identifiées entraînent une annotation incorrecte ou incomplète des séquences génomiques ; (ii) les séquences non cartographiées conduisent à la confusion entre les gènes paralogues et les gènes d’haplotypes différents ; et (iii) l’absence d’attribution et d’orientation des chromosomes ne permet pas de reconstruire la phylogénie de réarrangement et d’étudier l’évolution des chromosomes. L’élaboration de cartes physiques à haute résolution pour les espèces dont les génomes viennent d’être séquencés est un investissement opportun et rentable qui facilitera l’annotation du génome, l’analyse évolutive et le reséquençage des génomes individuels des populations naturelles^7,8.

Ici, nous présentons des approches innovantes de la préparation des chromosomes, de l’hybridation in situ fluorescente (FISH) et de l’imagerie qui facilitent le développement rapide de cartes physiques. En utilisant l’exemple d’An. gambiae, nous démontrons que le développement de cartes chromosomiques physiques peut potentiellement améliorer les assemblages du génome et, par conséquent, la qualité des analyses génomiques. Tout d’abord, nous utilisons une méthode à haute pression pour préparer les étalements des chromosomes polytènes. Cette méthode, développée à l’origine pour la drosophile⁹, permet à l’utilisateur de visualiser plus de détails sur les chromosomes que la technique d’écrasement habituelle¹⁰. Deuxièmement, un système frontal entièrement automatisé pour FISH est utilisé pour la cartographie physique du génome à haut débit. Le système automatisé de coloration sur lame exécute plusieurs tests simultanément et réduit considérablement le temps de manipulation¹¹. Troisièmement, un système d’imagerie fluorescente automatique, qui comprend une platine de diapositive motorisée, scanne et photographie automatiquement les chromosomes marqués après FISH¹². Ce système est particulièrement utile pour identifier et visualiser plusieurs plaques chromosomiques sur la même lame. De plus, le processus de balayage permet d’obtenir un résultat FISH plus uniforme. Dans l’ensemble, le protocole de mappage physique automatisé à haut débit est plus efficace qu’un protocole manuel standard.

Protocole

1. Préparation de chromosomes polytènes à haute pression à partir de cellules nourricières ovariennes

1. Disséquer des femelles anophèles semi-gravides 25 heures après l’alimentation sanguine sous un microscope de dissection et fixer les ovaires dans une solution de Carnoy fraîche modifiée avec du méthanol (100 % méthanol : acide acétique glacial, 3:1). À ce stade, les ovaires sont au stade de développement de Christopher III, lorsque les follicules ont une forme ovale et une zone transparente avec des cellules nourricières à l’intérieur des follicules a une forme ronde¹³. Mettez les ovaires d’environ cinq femelles dans 500 μl de solution de Carnoy modifiée dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et conservez-les à température ambiante pendant 24 heures. Transférer les ovaires à -20 °C pour un stockage à long terme.
2. Préparez la solution modifiée de Carnoy avec de l’éthanol (100 % d’éthanol : acide acétique glacial, 3:1) et 50 % d’acide propionique juste avant de faire les lames. Placez une paire d’ovaires sur une lame exempte de poussière dans une goutte de solution de Carnoy modifiée. Divisez les ovaires en environ 6 sections avec des aiguilles de dissection et placez-les en gouttes d’acide propionique à 50 % sur des lames propres sous un stéréomicroscope de dissection MZ6 Leica. Utilisez une diapositive distincte pour chaque section.
3. Séparez les follicules en les disséquant à l’aide d’aiguilles et essuyez les tissus restants avec du papier filtre ou une serviette en papier sous un microscope de dissection. Ajoutez une nouvelle goutte d’acide propionique à 50 % aux follicules et laissez-les reposer pendant 3 à 5 minutes à température ambiante. Placez une lamelle sur la gouttelette d’acide propionique à 50 %. Laissez la diapositive reposer pendant environ 1 minute.
4. Enveloppez la diapositive avec du papier filtre et du plastique. À l’aide d’un outil rotatif Dremel 200 avec un accessoire Flex-Shaft et une pointe en plastique souple réglée entre 3000 et 5000 tr/min, exprimez les follicules en faisant tourner la pointe en cercles et en appuyant légèrement sur la lamelle pour répartir uniformément les noyaux. Cette étape devrait prendre environ 1 minute. Vérifiez la qualité de la diffusion avec un microscope de phase Olympus CX41 à l’aide d’un objectif 20x.
5. Préparez un sandwich en plaçant une lamelle supplémentaire à côté de la lamelle recouvrant les chromosomes, et couvrez-les avec une deuxième lame de microscope. Cela réduit le risque d’écraser la glissière dans l’étau. Enveloppez les lames avec une feuille de plastique qui est livrée dans des récipients en verre et du papier filtre pour maintenir le sandwich et pour protéger la lame des rayures dues à l’étau.
6. Appliquer une pression sur les glissières à l’aide d’un étau mécanique. Une pression de 85 à 120 pouces-lb est suffisante et est obtenue à l’aide d’une clé dynamométrique. Cette étape est nécessaire pour aplatir au maximum les chromosomes.
7. Retirez la deuxième lame de microscope et la lamelle supplémentaire. Chauffer la lame avec la lamelle recouvrant les chromosomes à 55 °C sur un système de dénaturation/hybridation de lame pendant 10 à 15 minutes pour aplatir davantage les chromosomes. Trempez la lame dans de l’azote liquide pendant au moins 15 secondes et, lorsque les bulles ont cessé, retirez rapidement la lamelle avec une lame de rasoir. Placez immédiatement les lames dans de l’éthanol froid à 50 % pendant 5 minutes. Déshydratez les lames dans 70 %, 90 %, 100 % éthanol pendant 5 minutes chacune. Lames sèches à l’air.

2. FISH à l’aide d’un système automatisé de coloration des lames

programme est configuré avec le système automatisé de coloration des lames Xmatrx pour exécuter les étapes suivantes, à l’exception de l’étiquetage de la sonde. Le protocole détaillé de marquage par en-tête est décrit dans la documentation fournie avec l’ADN polymérase de Fermentas.

1. Avant FISH, préparez des sondes fluorescentes en marquant l’ADN génomique BAC avec un fluorochrome à l’aide d’un protocole de traduction d’entailles. Mélangez 1 μg d’ADN, 0,05 mM de dATP, dCTP et dGTP non marqués et 0,015 mM de dTTP, 1 μl de Cy3- ou Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml de BSA, 5 μl de tampon de traduction d’entaille 10x, 20 unités d’ADN polymérase I, 0,0012 unité de DNase I et de l’eau sans nucléase à 25 μl. Le rapport ADN polymérase I/DNase I est sélectionné empiriquement pour obtenir des sondes de taille comprise entre 300 et 500 pb. Incuber le mélange à 15 °C pendant 1 heure.
2. Placez les lames et les réactifs dans le système automatisé de coloration des lames Xmatrx et démarrez le programme pour exécuter les étapes suivantes. Appliquer 800 μl de 1x PBS pendant 20 min. Soufflez des diapositives avec de l’air. Effectuez la fixation du formol en appliquant 450 μl de formol à 4 % dans 1 PBS pendant 1 min, suivi de lavages avec de l’éthanol à 100 % pendant 1 seconde deux fois et pendant 2 min une fois. Soufflez des diapositives avec de l’air.
3. Chauffe à 45 °C pendant 2 min pour éviter les bulles lors de l’application des sondes. Appliquez 20 μl de sondes d’ADN, ajoutez des gouttes d’huile minérale pour éviter l’évaporation d’une solution d’hybridation et placez une lamelle sur le dessus. Dénaturer les chromosomes et les sondes d’ADN en chauffant les lames à 90 °C pendant 10 min.
4. Pour l’hybridation, incuber les lames à 42 °C pendant 14 heures avec les lamelles couvre-lames. La solution d’hybridation se compose de 2x SSC, 100 mM de phosphate de sodium, 1x solution de Denhardt, 100 μg/ml d’azoture de sodium et 10 % de sulfate de dextran dans du formamide.
5. Pour les lavages rigoureux, chauffer les lames à 42 °C pendant 2 min, retirer les lamelles, laver les lames en 2x SSC pendant 1 seconde 4 fois. Soufflez des diapositives avec de l’air. Appliquer 800 μl de SSC 0,4x à 42 °C pendant 10 min 2 fois. Laver les lames en 2x SSC à 25 °C pendant 10 min.
6. Effectuez une coloration chromosomique en appliquant 50 μl de 1 μM YOYO-1 dans 1x PBS. Appliquez des gouttes d’huile minérale pour éviter l’évaporation de la solution de coloration, mettez des lamelles et incubez à 25 °C pendant 10 min. Retirez les lamelles, lavez les lames en 2x SSC pendant 1 seconde 4 fois. Soufflez des diapositives avec de l’air. Appliquez 15 μl de réactif anti-décoloration ProLong Gold. Mettez des lamelles.

3. Lecture de diapositives avec un système d’imagerie fluorescente automatique

Cette section détaille l’utilisation du logiciel Duet, qui est livré en standard avec le système de balayage automatisé ACCORD PLUS. Les instructions commencent après la mise sous tension dans cet ordre : Alimentation Olympus U-RFL-T pour une ampoule halogène, ordinateur Dell precision T3500, microscope Olympus BX61 avec une caméra connectée Olympus U-CMAD3.

1. Pour configurer le pré-balayage 10x, ouvrez le logiciel Duet dans le système de balayage automatisé ACCORD PLUS. Cliquez sur le bouton « En ligne ». Entrez le nouvel ID de cas et attribuez un ID de diapositive. Cliquez sur le point intitulé « BF ». Il s’agit de l’option en fond clair. Réglez un choix de balayage sur « 10x Prescan ». Utilisez « cercle 2500x », « cercle 10000x » ou « rectangle ». Cliquez sur « Set&run » pour un pré-balayage 10x.
2. Cliquez sur le bouton « OK » pour exécuter le pré-balayage 10x. Suivez les instructions pour ajuster correctement la numérisation. Cliquez sur « Terminer » pour démarrer l’analyse. Appuyez sur l’onglet « Principal » pour revenir à l’écran principal. Cliquez sur le bouton « Hors ligne ». Recherchez l’ID de l’incident et l’ID de la diapositive qui ont été attribués et cliquez sur « Analyse hors ligne ». Dans la boîte noire en haut à gauche, cliquez sur une flèche et sélectionnez « 10x Prescan ». À l’aide des flèches (< || Δ > alias les boutons « retour », « pause », « lecture », « avance »), parcourez les images numérisées.
3. Après avoir trouvé une image d’intérêt, double-cliquez sur l’écran au milieu de la zone cible et appuyez sur « Snap ». Cela ciblera une image à capturer plus tard. Après avoir sélectionné toutes les cibles, cliquez sur « Classer ». Sélectionnez « Prébalayage 10x ». Faites un clic droit sur une image et avez la possibilité de classer les images. Sélectionnez « Polytene ».
4. Configurez le pré-scan 40x dans le logiciel Duet. Cliquez sur « Principal » pour revenir au menu principal. Sélectionnez à nouveau « En ligne ». Sélectionnez une diapositive. Remplacez « BF » par « FL ». Remplacez le nom de la tâche par « Revisit-X40-RG ». Changez la section juste en dessous du dernier paramètre en « Revisit-ALL ». Cliquez sur « Set&Run ». Appuyez sur « OK ». Suivez à nouveau les invites pour configurer l’automatisation. Cliquez sur le bouton « Commencer à faire correspondre les vues » pour faire correspondre les images 10x et 40x. Cliquez sur « Terminer » pour démarrer l’analyse. Une fois cela fait, cliquez sur « Classifier » et regardez les images.

4. Résultats représentatifs

La figure 1 illustre graphiquement le schéma de la préparation des chromosomes à haute pression. Cette étape implique le processus d’écrasement et d’aplatissement des chromosomes à l’aide d’un outil Dremel et d’un étau mécanique, ainsi que la visualisation des chromosomes à l’aide d’un microscope à contraste de phase. La figure 2 illustre l’hybridation d’une sonde marquée par fluorescence pour cibler l’ADN sur les préparations de lames chromosomiques à l’aide d’un système automatisé de coloration des lames, l’utilisation d’un microscope à balayage automatisé pour visualiser et cartographier les sondes après l’expérience FISH, et placer et orienter les échafaudages génomiques sur les chromosomes.

Des préparations de chromosomes polytènes de cellules nourricières ovariennes à partir de femelles d’An. gambiae ont été réalisées à l’aide de la technique à haute pression. Cette méthode n’endommage ni ne modifie la majeure partie de la structure chromosomique (Figure 3). Il aplatit les chromosomes pliés et, ainsi, révèle de fines bandes cachées qui ne sont pas visibles sur les préparations régulières (Figure 4).

Les sondes utilisées dans ce protocole sont des clones d’ADN BAC génomique obtenus à partir d’une banque BAC ND-TAM générée à partir de l’ADN de la souche PEST d’An. gambiae. L’ADN génomique de cette banque a été extrait de larves du premier stade nouvellement écloses des deux sexes. La figure 5 montre les résultats de l’étude FISH à l’aide de clones BAC hybridés à des chromosomes polytènes d’An. gambiae. Cette procédure a été réalisée à l’aide du système automatisé de coloration des lames Xmatrx. À l’aide d’une photocarte cytogénétique d’An. gambiae¹⁰, deux clones BAC, 102B24 (GenBank : BH372701, BH372694) et BAC 142O19 (GenBank : BH368703, BH368698), ont été localisés dans les subdivisions 16C et 16D du bras 2R, respectivement. Cependant, la recherche BLAST contre l’assemblage ¹⁴ de la souche PEST AgamP3 d’An. gambiae a permis d’identifier les séquences homologues à 102B24 et 142O19 dans les subdivisions 16B et 17A du bras 2R, respectivement (tableau 1). Par conséquent, la correspondance entre les coordonnées génomiques et les subdivisions cytogénétiques peut maintenant être ajustée en fonction de nos données de cartographie. La recherche BLAST contre les assemblages génomiques de la forme M et de la forme S d’An. gambiae a révélé que les deux clones BAC sont situés dans des contigs différents, mais dans les mêmes échafaudages à l’intérieur de chaque forme (Tableau 1). Les contigs identifiés peuvent maintenant être associés à des emplacements chromosomiques spécifiques. De plus, les échafaudages identifiés peuvent maintenant être correctement orientés à l’intérieur des subdivisions cytologiques 16CD. Il est intéressant de noter que les distances entre les séquences 102B24 et 142O19 dans les échafaudages sont de 1 892 981 pb, 1 658 391 pb et 1 688 426 pb dans les assemblages de génomes de la souche PEST, de la forme M et de la forme S, respectivement. Étant donné que la souche PEST est un hybride entre les formes M et S, cette différence est probablement due à un assemblage incorrect du génome de PEST.

BAC (adhésion)	Souche PEST AgamP3 Coordonnées	M-form contigs Coordonnées	M-form échafaudages Coordonnées	Forme S contigs Coordonnées	Forme S échafaudages Coordonnées
102B24 (BH372694)	2R :AAAB0100 8844_26 (16B) 43 681 342- 43 681 874	ABKP020247 53.1 32 513- 33 045	EQ090167.1 1 858 377- 1 858 909	ABKQ010123 32.1 4 299- 4 832	EQ099711.1 215 891- 216 424
102B24 (BH372701)	2R :AAAB0100 8844_28 (16B) 43 788 213- 43 788 969	ABKP020247 51.1 24 816- 25 575	EQ090167.1, 1 772 683- 1 773 442	ABKQ010123 35.1 27 782- 28 540	EQ099711.1, 305 514- 306 272
142O19 (BH368698)	2R :AAAB0100 8805_5 (17A) 45 428 580-< > 45 429 264	ABKP020247 01.1 2 499-< > 3 185	EQ090167.1 315 806- 316 492	ABKQ010123 76.1 49 242- 49 942	EQ099711.1 1 791 625- 1 792 325
142O19 (BH368703)	2R :AAAB0100 8805_8 (17A) 45 560 099- 45 574 323	ABKP020220 17.1 30 971- 32 469	EQ090167.1 200 518- 202 016	ABKQ010123 79.1 27 760- 28 508	EQ099711.1 1 903 569- 1 904 317

Table 1. Résultats BLAST des séquences de l’extrémité BAC contre les assemblages génomiques d’An. gambiae.

Graphique 1. Représentation schématique de la préparation des chromosomes à haute pression. Les ovaires des moustiques sont montrés au bon stade de développement.

Graphique 2. Un schéma représentant l’automatisation FISH, le balayage de lames et la cartographie chromosomique d’échafaudages génomiques.

Graphique 3. Une propagation du chromosome 3 polytène d’An. gambiae obtenue à l’aide de la technique à haute pression. 3L et 3R marquent les bras gauche et droit au niveau de leurs télomères. PH et IH indiquent respectivement une hétérochromatine péricentrique et intercalaire.

Graphique 4. Comparaison des chromosomes polytènes d’An. gambiae préparés à l’aide de la technique traditionnelle (en haut) et à haute pression (en bas). Les images couvrent les subdivisions 29A-30E du bras 3R (A) et 43D-46D du bras 3L (B).

Graphique 5. FISH de clones BAC à chromosomes polytènes d’An. gambiae. A) Hybridation de 102B24 (signal rouge) avec le bras 2R. B) FISH bicolore de 102B24 (signal rouge) et 142O19 (signal bleu) aux subdivisions 16C et 16D du bras 2R étiré, respectivement. Les flèches indiquent les signaux d’hybridation de clones BAC marqués avec Cy3 (rouge) et Cy5 (bleu). C-la région centromérique. a/+ montre l’inversion hétérozygote 2La. Les chromosomes ont été contre-colorés avec le fluorophore YOYO-1.

Discussion

L’étape la plus critique de la procédure à haute pression est l’écrasement approprié des cellules nourricières ovariennes isolées au stade III du développement ovarien de Christopher¹³. Un écrasement inadéquat peut entraîner une dispersion insuffisante des chromosomes, ce qui peut poser des problèmes lors de la détermination de l’emplacement des sondes après FISH. Si les chromosomes sont trop écrasés, ils peuvent être cassés ou allongés au point de perdre les motifs de bandes. La production de plusieurs lames devrait conduire à une cohérence lors de la tentative d’écrasement des diapositives à l’aide de l’outil Dremel, ce qui augmentera l’efficacité globale de la production de diapositives. La technique à haute pression a d’abord été développée pour les glandes salivaires fraîchement isolées de D. melanogaster⁹. Cependant, les ovaires des moustiques sont systématiquement conservés dans une solution fixatrice de Carnoy modifiée (3 méthanol : 1 acide acétique glacial en volume) avant d’être utilisés pour des préparations chromosomiques. Par conséquent, nous avons modifié le protocole à haute pression existant pour le rendre adapté aux chromosomes polytènes des cellules nourricières ovariennes fixes du moustique du paludisme An. gambiae. Parce que la haute pression est appliquée à l’aide d’un étau de précision possédant une surface de travail très parallèle de l’ensemble de la lame, il faut beaucoup moins de temps pour préparer la courge chromosomique qu’en utilisant une technique de tapotement traditionnelle avec une gomme de crayon.

D’autres étapes importantes comprennent le trempage suffisant des follicules dans de l’acide propionique à 50 % et le chauffage de la lame. Ces deux étapes sont essentielles pour aider à aplatir les chromosomes. S’ils sont négligés, les chromosomes peuvent apparaître brillants après la déshydratation, ce qui peut conduire à une surabondance de fond qui peut être confondu avec un signal chez FISH. La technique d’écrasement à haute pression fonctionne également bien en utilisant les mêmes solutions lors de la préparation de chromosomes mitotiques. L’étalement et l’aplatissement supplémentaires aident à mieux exprimer les chromosomes à partir de leurs noyaux. L’ajout d’une pression égale devrait les aplatir en conséquence pour permettre des mesures et potentiellement une meilleure résolution des bandes visibles par la coloration. Les détails sur l’isolement des chromosomes mitotiques des moustiques sont donnés ailleurs¹⁵. Bien que les préparations de courge régulières soient suffisantes pour de nombreuses utilisations, y compris FISH ¹⁶ et l’immunocoloration¹⁷, la méthode à haute pression réduit non seulement la variance potentielle d’une lame à l’autre, mais augmente également la qualité globale des chromosomes, ce qui permet d’obtenir plus de détails lors de la cartographie des chromosomes. Cette procédure peut également être utilisée pour préparer des lames de membrane chromosomique polytène pour la microdissection par capture laser.

Les limites de la méthode à haute pression comprennent la rupture de la lame et l’étirement excessif des chromosomes. La rupture de la glissière causée par une contrainte trop importante sur la glissière via l’étau est possible, mais elle est limitée par l’utilisation des pressions indiquées dans l’article. En cas d’étirement excessif des chromosomes, si l’outil Dremel est appliqué sur la lame pendant une période prolongée, il est possible que les chromosomes deviennent trop étirés et perdent de la résolution. Il est possible d’y remédier en appliquant l’outil pendant une brève période, en vérifiant au microscope et en appliquant plus de temps avec l’outil Dremel si les chromosomes ne sont pas suffisamment étalés.

Un protocole FISH traditionnel comprend un certain nombre d’étapes de lavage et d’incubation, qui durent généralement de 5 à 20 minutes et nécessitent presque toute l’attention d’un chercheur pendant toute la durée de l’expérience. De plus, le nombre de lames pouvant être manipulées manuellement est généralement limité à quelques lames dans une expérience donnée. En revanche, un système automatisé de coloration des lames effectue automatiquement toutes les étapes (y compris le lavage, l’incubation, l’application de la sonde, la dénaturation, l’hybridation, l’application et l’élimination des lamelles). Cela libère jusqu’à 6 à 8 heures de travail pour un chercheur dans une expérience FISH. De plus, un système FISH automatisé peut augmenter considérablement le débit. Par exemple, le système Xmatrx est capable de traiter jusqu’à 40 dosages sur des lames de préparation simples et jusqu’à 80 dosages sur des lames de préparation doubles simultanément. L’une des limites de ce système est qu’il n’est pas efficace pour un petit nombre d’expériences FISH car il nécessite la préparation de grands volumes de solutions. De plus, le protocole FISH programmé dans le système peut nécessiter des modifications et des ajustements pour de nouvelles applications.

Un système de balayage de lames est une version automatisée d’un microscope fluorescent. Le déplacement automatisé de la platine et un panneau de commande de microscope simple libèrent du temps au chercheur et rendent l’utilisation du microscope extrêmement simple. Par exemple, le logiciel du système de balayage ACCORD PLUS permet de capturer facilement plusieurs canaux de fluorescence et de gérer facilement l’acquisition d’images. Un exemple de ceci est l’inclusion de la capture z-stack, plutôt que de prendre une seule image ; Le logiciel capture une pile Z configurable d’images pour s’assurer qu’au moins une image reste nette. Bien que ce système soit davantage conçu pour l’acquisition de plusieurs images (beaucoup de cellules sur une seule lame), il rend la recherche de chromosomes sur la lame beaucoup plus facile que la navigation manuelle dans la lame.

Le système automatisé de coloration des lames et le système de balayage sont couramment utilisés pour le diagnostic FISH des anomalies chromosomiques dans les cellules humaines par les cliniques de cytogénétique. Dans cette étude, nous avons développé un protocole qui utilise ces systèmes automatisés pour une application de recherche fondamentale. Le protocole automatisé de cartographie physique à haut débit peut faciliter le développement rapide de cartes chromosomiques physiques pour toute espèce d’intérêt. Bien que, dans ce rapport, nous ayons utilisé des chromosomes polytènes pour la cartographie physique, les chromosomes mitotiques peuvent également être utilisés avec ces systèmes. Il serait utile que le protocole soit adapté aux chromosomes mitotiques car la majorité des organismes ne développent pas de chromosomes polytènes lisibles. Cependant, les chromosomes polytènes, lorsqu’ils sont disponibles, peuvent fournir des informations utiles sur la correspondance des domaines fonctionnels du génome avec la structure chromosomique à la plus haute résolution. Les principes d’organisation des chromosomes polytènes, tels que les motifs de bandes et d’interbandes, ont récemment été comparés à ceux des chromosomes non polytènes (interphases) réguliers¹⁸. Par conséquent, la cartographie physique détaillée effectuée sur les préparations chromosomiques à haute pression a le potentiel de relier les séquences d’ADN à des structures chromosomiques spécifiques telles que les bandes, les interbandes, les bouffées, les centromères, les télomères et l’hétérochromatine ; créant ainsi des assemblages génomiques basés sur les chromosomes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lamelles de microscope 22x22 mm	Fisher	12-544-10
Lamelles de microscope 18x18 mm	Fisher	12-553-402
Acide acétique	Fisher	A491-212
Méthanol	Fisher	A412-4
Acide propionique	Sigma-Aldrich	402907
Dremel 200 outil rotatif avec Flex-Shaft accessoire	Rand		3" Mini Moulin d’établi polyvalent (avec limiteur de vitesse)
Spécialement conçu 200 &mu ; l pointes en plastique (bords en plastique perlés) pour outil Dremel	Pipetman	F171300	Couper et chauffer l’extrémité grasse des pointes de pipette
Étau rapide revêtu d’étain	Avenger Gold Toolmaker	MTC-200-1	Rectifié avec précision carré et parallèle à 0,00025
Clé dynamométrique	Craftsman	44593
Système de dénaturation/hybridation de lames ThermoBrite	Abbott Molecular	30-144110
Lames de barrière de 25 mm	Abbott Molecular	XT108-SL
Lamelles de recouvrement de 25 mm	Abbott Molecular	XT122-90X
Xmatrx Système automatisé de coloration des lames	Abbott Molecular	08L46-001
MZ6 Stéréomicroscope Leica		Leica VA-OM-E194-354	Un stéréomicroscope différent peut être utilisé
Olympus CX41 Microscope de phase	Olympus	CX41RF-5	Un microscope à phase différente peut être utilisé
ACCORD PLUS Système de balayage automatisé	BioView (USA)	BV-5000-ACCP
10x	PBS Invitrogen	P5493
10 % NBF (formol tamponné neutre)	Sigma-Aldrich	HT501128
99 % formamide	Fisher Scientific	BP227500
Sulfate de dextran sel de sodium	Sigma	D8906
20x Tampon SSC	Invitrogen	AM9765
Phosphate de sodium	Sigma-Aldrich	S3264
50x solution de Denhardt	Sigma-Aldrich	D2532
Azoture de sodium	Sigma-Aldrich	S2002
1 mM YOYO-1 solution d’iodure (491/509) dans DMSO	Invitrogen	Y3601
Réactif anti-décoloration ProLong Gold	Invitrogen	P36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Fermentas	R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP	GE Healthcare	PA53022, PA55022
BSA	Sigma	A3294
ADN polymérase I	Fermentas	EP0041
DNase I	Fermentas	La norme EN0521