Dans ce protocole, nous décrivons la production, la purification et le titrage des vecteurs lentiviraux. Nous donnons un exemple de transfert de gènes lentiviraux vecteur médiation dans neurones en culture primaire et les astrocytes. Nos méthodes peuvent également s'appliquer à d'autres types cellulaires In vitro Et In vivo.
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Article de méthode
La production de vecteurs lentiviraux pour les cellules de transduction du Système Nerveux Central
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une livraison efficace des gènes dans le système nerveux central (SNC) est importante pour l'étude des fonctions géniques, la modélisation des maladies neurologiques et le développement d'approches thérapeutiques. Les vecteurs lentiviraux sont des outils intéressants pour la transduction des neurones et d'autres types cellulaires du SNC, car ils transduisent à la fois les cellules en division et les cellules non divisantes, permettent une expression prolongée des transgènes, et possèdent une capacité d'emballage relativement élevée ainsi qu'une faible toxicité 1-3. Les vecteurs lentiviraux ont été utilisés avec succès pour transduire de nombreux types de cellules nerveuses in vitro 4-6 ainsi que chez l'animal 7-10.
De grands efforts ont été déployés pour développer des vecteurs lentiviraux offrant une meilleure sécurité biologique et une efficacité accrue pour la livraison de gènes. Les vecteurs lentiviraux actuels de troisième génération, défectifs pour la réplication et auto-inactivants (SIN), sont illustrés dans la Figure 1. Les éléments requis pour l’emballage du vecteur sont répartis entre quatre plasmides. Dans le plasmide de transfert lentiviral, la région U3 de la répétition terminale longue (LTR) en 5' est remplacée par un promoteur fort provenant d’un autre virus. Cette modification permet la transcription de la séquence du vecteur indépendamment de la protéine Tat du VIH-1, normalement nécessaire pour l’expression des gènes viraux 11. Le signal d’emballage (Ψ) est essentiel à l’encapsidation, et l’élément de réponse à Rev (RRE) est requis pour produire des vecteurs à haut titre. Le tractus polypurinique central (cPPT) joue un rôle important dans l’importation nucléaire de l’ADN du vecteur, une caractéristique indispensable pour la transduction de cellules non divisantes 12. Dans le LTR en 3', les séquences régulatrices en cis sont entièrement supprimées de la région U3. Cette délétion est copiée vers le LTR en 5' après la transcription inverse, entraînant l’inactivation transcriptionnelle des deux LTR. Le plasmide pMDLg/pRRE contient les gènes gag/pol du VIH-1, qui fournissent les protéines structurales ainsi que la transcriptase inverse. Le plasmide pRSV-Rev code pour la protéine Rev, qui se lie au RRE afin de permettre une exportation efficace de l’ARN hors du noyau. Le plasmide pCMV-G code pour la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G), qui remplace l’Env du VIH-1. La VSV-G élargit le tropisme des vecteurs et permet leur concentration par ultracentrifugation 13. Tous les gènes codant pour les protéines accessoires, notamment Vif, Vpr, Vpu et Nef, sont exclus du système d’emballage. La production et la manipulation des vecteurs lentiviraux doivent être réalisées conformément aux recommandations du NIH relatives aux recherches impliquant de l’ADN recombinant (http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf). Une autorisation de la part du comité institutionnel de sécurité biologique et chimique peut être requise avant d’utiliser des vecteurs lentiviraux. Les vecteurs lentiviraux sont généralement produits par cotransfection de cellules 293T avec un plasmide de transfert lentiviral et des plasmides auxiliaires codant pour les protéines nécessaires à l’emballage du vecteur. De nombreux plasmides de transfert lentiviraux et plasmides auxiliaires sont disponibles auprès d’Addgene, un dépôt non lucratif de plasmides (http://www.addgene.org/). Certaines lignées cellulaires d’emballage stables ont été développées, mais ces systèmes offrent moins de souplesse et leur efficacité d’emballage diminue généralement avec le temps 14, 15. Des kits de transfection commerciaux peuvent assurer une efficacité élevée de transfection 16, mais ils peuvent s’avérer très coûteux pour la production à grande échelle de vecteurs. Les méthodes de précipitation par phosphate de calcium permettent une transfection très efficace des cellules 293T, offrant ainsi une approche fiable et économique pour la production de vecteurs lentiviraux.
Dans ce protocole, nous produisons des vecteurs lentiviraux par cotransfection de cellules 293T avec quatre plasmides selon le principe de précipitation au phosphate de calcium, suivie d'une purification et d'une concentration par ultracentrifugation à travers un coussin de saccharose à 20 %. Les titres des vecteurs sont déterminés par analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou par qPCR en temps réel. La production et la titration des vecteurs lentiviraux selon ce protocole peuvent être réalisées en 9 jours. Nous fournissons un exemple de transduction de ces vecteurs dans des cultures néocorticales murines contenant à la fois des neurones et des astrocytes. Nous démontrons que les vecteurs lentiviraux permettent une forte efficacité de transduction et une expression génique spécifique aux types cellulaires dans des cellules primaires issues du SNC.
Protocole
1. Emballage de vecteurs lentiviraux
Les vecteurs lentiviraux sont produites par co-transfection d'un vecteur lentiviral de transfert et d'autres plasmides requis pour l'emballage dans des cellules 293T par la méthode de transfection au phosphate de calcium. Nous utilisons 10 100-mm boîtes de culture tissulaire dans ce protocole. Il peut être agrandie ou réduite en fonction des applications. La lignée cellulaire 293T est maintenue dans un milieu de Dulbecco Eagle modifié (DMEM) avec du glucose à haute (4500 mg / L), supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 100 unités / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine à 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2.
- Semences 293T cellules à confluence de 30-40% à 10 100 mm boîtes de culture tissulaire (3 x 10 6 cellules / boîte) dans un milieu de culture. Retour des cellules de l'incubateur.
- Après 20-24 h de culture, vérifier la densité cellulaire. Les cellules doit être d'environ 80% de confluence au moment de la transfection.
- Préparer un tube de 50 ml. Ajouter 4,4 ml TE79/10 (1 mM Tris-HCl, 0,1 mML'EDTA, pH 7,9) moins le volume total de l'ADN plasmidique suivant. Ajouter 100 ug transfert lentiviral plasmide (figure 1), 58 mg pMDLg / pRRE, 31 ug pCMV-G, 25 ug pRSV-Rev, 600 pi 2M CaCl 2. Mélanger délicatement.
- Préparer un autre tube de 50 ml. Ajouter 5 ml 2x HBS (0,05 M de HEPES, 0,28 M de NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 7,12).
- Prenez l'ADN-CaCl 2 par mélange de 10 ml pipette et ajouter dans le tube contenant 2 x HBS, goutte à goutte tout en vortex le tube.
- Gardez la réaction de précipitation à la température ambiante (RT) pendant 30 min.
- Retirer les boîtes de culture de pépinière. Mélanger la réaction de précipitation et par vortex. Ajouter 1 ml de suspension à chacune des cellules plat de 100 mm contenant. La suspension doit être ajouté lentement, goutte à goutte tout en remuant doucement le support dans le plat. Retour de ces plats à l'incubateur et laisser reposer pendant 5 h.
- Retirer le milieu de la culture. Ajouter 6 ml milieu de culture frais contenant 6 mM de sodium butyrate à chaque plat. Retour aux cultures de l'incubateur. Après une nuit de culture, s'il ya un rapporteur fluorescent dans la construction, vérifier l'expression du gène rapporteur sous microscope à fluorescence. Habituellement, plus de 80% des cellules expriment le gène rapporteur si elle est entraînée par un promoteur ubiquiste (par exemple promoteur CMV).
- Deux jours (40-44 h) après la transfection, ramasser le surnageant à partir de 10 plats en 2 tubes de 50 ml (environ 30 ml dans chaque tube). Congeler le surnageant dans congélateur à -80 ° C ou aller à l'étape suivante.
2. La concentration et la purification des vecteurs
- Centrifuger le fraîchement prélevé ou décongelés surnageant à 900 g (environ 2000 tours par minute) pendant 10 min pour enlever tous les débris de cellules dans le surnageant.
- Fixer une seringue de 60 ml, à un filtre de 0,2 um-SFCA seringue. Transférer surnageant de 50 ml tube de la seringue. Filtrer le surnageant dans un tube à centrifuger polyallomère.
- Prenez 5 ml de saccharose à 20% (préparé dans du PBS) dans une pipette de 5 ml. Insérerla pipette à la partie inférieure du tube de centrifugeuse contenant surnageant. Ajouter lentement la solution de saccharose dans le surnageant vecteur. Répétez ces étapes pour surnageant d'un autre tube.
- Centrifuger le surnageant à 11000 rpm et 4 ° C pendant 4 h avec rotor Beckman SW28 balançoire.
- Eliminer le surnageant. Ajouter 150 ul Lactose 4% (préparé dans du PBS) à chaque tube de la centrifugeuse. Remettre en suspension les culots.
- Transfert du vecteur concentré de tous les tubes à centrifuger dans un tube de 1,5 ml. Laisser le tube sur la glace pendant 15 min.
- Mélanger la suspension vecteur par pipetage. Spin avec microcentrifugeuse à pleine vitesse (environ 16000 g) pendant 1 min.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Divisez l'échantillon final en 20 aliquotes et les a entreposés dans congélateur à -80 ° C.
3. Le titrage des Vecteurs
- Graine 5 x 10 4 / puits de cellules HT1080 12 à plaque de puits dans 1 ml du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS.
- Après overnigla culture ht, compter les cellules d'un puits et marquer le nombre de cellules.
- Faire 5 fois de dilution en série (1:5, 1: 25; 1:125, et 1:625) du vecteur concentrée avec du milieu de culture. Ajouter I ul de chaque vecteur dilués dans les puits séparés. Les échantillons peuvent être dupliquées pour augmenter la précision.
- Ajouter une pi 4 mg / ml polybrène (bromure d'hexadiméthrine) dans chaque vecteur de puits contenant et dans un puits sans vecteur. Mélanger en secouant doucement la plaque. Retour à l'incubateur pendant 48 h.
- Evacuer le milieu des puits de culture cellulaire. Laver chaque puits avec du PBS. Ajouter 250 pi 1x trypsine-EDTA solution aux cellules. Lorsque les cellules se détachent (3-5 min), ajouter 1 ml milieu de culture. Remettre en suspension les cellules par pipetage. Transfert suspension cellulaire à 1,5 ml tubes à centrifuger.
- Centrifuger à 900 g pendant 6 min. Pour les vecteurs avec un gène rapporteur fluorescent (par exemple GFP), passez à l'étape 3.7 pour l'analyse FACS. Pour les vecteurs sans un journaliste, passez à l'étape 3.8 pour qPCR en temps réel.
- Pour les vecteurs contenant un fluogène rapporteur fluorescentes, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot avec 300 ul de 3,7% de formaldéhyde dans du PBS. Déterminer le pourcentage des cellules rapporteur positifs par analyse par FACS. Le titre sera représenté sous forme d'unités de transduction par millilitre concentrée vecteur (TU / ml).
Par exemple, si 1 x 10 5 cellules a été transduites avec pl 1/25 (0,04 pi) du vecteur et les cellules de 30% sont positifs journaliste, le titre sera:
N'utilisez que les dilutions tomber dans une relation linéaire entre le pourcentage de cellules positives et la quantité de vecteur ajoutée pour calculer le titre. Le titre final doit être une moyenne des titres obtenus à partir de transductions d'au moins 2 montants différents du vecteur.
- Pour les vecteurs sansgène rapporteur fluorescent, extraire l'ADN génomique de cellules HT1080 en utilisant QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) selon le protocole du fabricant. Amplifier la séquence du vecteur dans l'ADN génomique en utilisant ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) avec des amorces (en matière de VIH-1 PBS / psi région 17) 5'-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 'et 5'-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3', et la sonde TaqMan 5 '-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3'. Gène de l'albumine qui est un gène à copie unique dans le génome (2 copies par cellule) a également été amplifiée avec les amorces 5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 'et 5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3', et la sonde 5'-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3 «comme un contrôle interne. Déterminer les nombres de copies du vecteur et de l'albumine par PCR dans la plaque de 96 puits selon l'instruction de la fabrication avec le programme suivant: 50 ° C pendant 2 min, 95 ° C pendant 10 min, et 35 cycles de 95 ° C pendant 15 secondes et 60 ° C pendant 2 min. Dix-dilutions de plasmides de concentration connue (représenté sous forme de copienombre) contenant les séquences de matrice doit également être amplifié pour créer une courbe d'étalonnage pour la quantification des échantillons inconnus. Le titre sera représenté sous forme d'unités d'intégration par millilitre concentrée vecteur (UI / ml).
4. La transduction de cultures néocorticaux
Cultures néocorticaux contenant à la fois les neurones et les cellules gliales sont préparés à partir de cortex de souris en utilisant un procédé de revêtement en deux étapes, comme décrit précédemment 18. Neocortices obtenus à partir de souris fœtales à 14-16 jours de gestation sont étalées sur une monocouche précédemment établi gliales dans du MEM supplémenté avec 10% de FBS, 20 mM de glucose et 2 mM de glutamine de 24 puits plaque de culture tissulaire.
- Après 5 jours in vitro, ajouter 10 uM cytosine arabinoside (Ara-C) dans la CENALla culture ortical pour inhiber la division cellulaire non-neuronales. Continuer la culture des cellules pendant 2 jours.
- Milieu de culture chaud à 37 ° C bain-marie pendant 5-10 min. Remplacer l'Ara-C contenant un milieu de milieu de culture frais (500 pl / puits).
- Ajouter vecteur avec désirée IAM (multiplicité d'infection, le rapport du nombre de particules de vecteur au nombre de cellules cibles) à la culture. Continuer la culture pendant 24 h. Nous utilisons MOI de 1-10 (généralement 5) dans des cultures primaires corticales.
- Remplacez le milieu de culture par du milieu frais. Continuer la culture. Si il ya un gène rapporteur dans la construction de vecteur, vérifiez les cellules sous un éclairage fluorescent microscope 2 jours après transduction. Expression du gène rapporteur est visible dans les neurones 2-7 après transduction, en fonction de la conception du vecteur et la dose utilisée.
5. Les résultats représentatifs
Les titres de vecteurs lentiviraux produites avec cette gamme protocole 10 8 -10 10 UI / ml, WHICh sont adaptés pour la transduction d'une variété de types de cellules du SNC à la fois in vitro et in vivo. tableau 1 et figure 2 montrent un résultat représentatif en utilisant les vecteurs produits par ce protocole. Nous transduites murins cultures néocorticales avec des vecteurs lentiviraux exprimant la protéine fluorescente verte (GFP), contrôlée par synapsine (SYN) promoteur ou gliale la protéine acide fibrillaire (GFAP) promoteur. Sept jours après transduction, nous avons effectué immunomarquage pour les neurones et les astrocytes étiquettes avec des anticorps anti-neun et anti-GFAP, respectivement. Comme le montre le tableau 1 et fig. 2A, après transduction avec le vecteur portant le promoteur synapsine, plus de 90% des neurones (cellules + de Neun) expriment la GFP et aucun astrocytes (GFAP + cellules) exprimer ce gène rapporteur. Lorsque le promoteur GFAP est utilisé dans la construction du vecteur (figure 2B), environ 80% des astrocytes (GFAP + cellules) expressions GFP; tous les cellules GFP + sont les astrocytes comme l'a confirmé par colocalisation avec la GFAP et l'absence d'expression de la GFP dans les cellules NeuN-étiquetés. Ces résultats démontrent que les vecteurs lentiviraux sont très efficaces pour fournir des transgènes à des cellules de CNS et de l'expression génique des cellules spécifiques peuvent être obtenus lorsque les promoteurs appropriés sont utilisés.
Figure 1. Représentation schématique du VIH à base de vecteurs lentiviraux et les plasmides d'emballage. Le provirus VIH-1 est affiché en haut. Les éléments de production de vecteur sont séparés en quatre différents plasmides. Le transfert lentivirale plasmide contient un hybride 5 'LTR dans lequel la région U3 est remplacé par le cytomégalovirus (CMV), le signal d'encapsidation (ψ), la séquence RRE, le tube polypurique centrale (cPPT), un gène d'intérêt (par exemple une rapporteur fluorescent) le long d'un promoteur de choix, et l'extrémité 3 'LTR dans lequel leséquences cis réglementaires sont complètement retirés de la région U3. pMDLg / pRRE contient les gènes gag et pol et RRE séquence de VIH-1 sous le contrôle du promoteur CMV. pRSV-Ap contient la séquence codante de Rev dirigée par le promoteur RSV. pCMV-G contient le gène de protéine VSV-G sous le contrôle du promoteur CMV. PA indique que le signal de polyadénylation de l'homme β-globine.
Figure 2. Expression de gènes rapporteurs dans la souris culture mixte néocorticale transduits avec des vecteurs lentiviraux porteurs de cellules spécifiques au type de promoteurs. Les cultures ont été transduites avec LV-SYN-GFP (A) ou LV-GFAP-GFP vecteurs (B) à une MOI de 5. Sept jours après transduction, les cellules ont été immunomarquées avec anticorps anti-NeuN ou anti-GFAP. Panneaux supérieurs montrent fluorescence de la GFP, les panneaux du milieu montrent immunocoloration et panneaux inférieurs sont fusionnés images (GFP: vert; NeuN ou GFAP: rouge).
| Vecteur | Cellules GFP + dans les neurones | + GFP dans les astrocytes |
| LV-SYN-GFP | 92,2 ± 7,3 | 0 |
| LV-GFAP-GFP | 0 | 78,3 ± 11,5 |
Tableau 1. Comparaison de l'expression de la GFP dans murins cultures néocorticales transduits avec des vecteurs lentiviraux portant des promoteurs différents: a.
quelques cultures néocorticales murins (5 x 10 5 / puits dans 24 puits) ont été transduites avec le LV-SYN-GFP ou LV-GFAP-GFP à une MOI de 5. Sept jours après transduction, les cultures ont été fixées et immunocolorées pour NeuN ou GFAP. Le nombre de cellules GFP et NeuN / GFAP exprimant ont été comptés dans les images à partir de 10 champs par condition expérimentale. Les valeurs représentent le pourcentage de neurones (cellules + de Neun) ouastrocytes (GFAP + cellules) qui ont également exprimé le gène rapporteur GFP. Les valeurs indiquées sont des moyennes ± SD de trois expériences indépendantes.
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Discussion
Dans ce protocole, nous avons montré la production de vecteurs lentiviraux et l'application de ces vecteurs dans les cultures néocorticales. Nous avons démontré l'efficacité et de la cellule spécifique au type de transduction par les vecteurs produits par ces méthodes. Lorsque le promoteur synapsine est utilisé, expression de la GFP est strictement neurone spécifique. Lorsque le promoteur GFAP est utilisé, expression de la GFP est exclusivement dans les astrocytes. Si aucune cellule spécifique au type d'expr...
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le NIH Neuroscience Blueprint subvention de base (P30 NS057105, BJS) à l'Université de Washington, le Programme de subvention de projet NS032636 (BJS) et par le Centre de l'espoir pour les troubles neurologiques.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Sérum de veau fœtal | Hyclone | SV3001403 | |
| PBS | Mediatech | 21-040-CM | |
| Trypsine-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| Le butyrate de sodium | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Hexadiméthrine bromure de (polybrène) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Des cellules 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| Cellules HT1080 | ATCC | CCL-121 | |
| Falcon 100 x 20 mm tissus culturplat e | BD Biosciences | 353003 | |
| 1 x 3 ½ tube de la centrifugeuse polyallomoer | Beckman-Coulter | 326823 | |
| De 0,2 micron filtre à seringue | Corning | 431219 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
Références
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Réimpressions et autorisations
