L'isolement et la caractérisation des cellules dendritiques et les macrophages de l'intestin de souris

Résumé

Ici, nous détaillons une méthode pour l'isolement rapide des cellules dendritiques de souris intestinales (DCS) et les macrophages. Caractérisation phénotypique des CD intestinales et les macrophages est effectuée en utilisant plusieurs couleurs d'écoulement analyse cytométrique tandis magnétique enrichissement bourrelet suivie par tri cellulaire est utilisé pour donner des populations de grande pureté pour des études fonctionnelles.

Résumé

Dans l'intestin résident les populations uniques de innées et adaptatives des cellules immunitaires qui sont impliqués dans la promotion de la tolérance envers la flore commensale et d'antigènes alimentaires tout en concomitance sur le point restant à monter vers les réponses inflammatoires ^1,2 pathogènes invasifs. Cellules présentatrices d'antigènes, en particulier les macrophages, les PED et jouent un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie intestinale immunitaire par leur capacité de détecter et de répondre de façon appropriée le microbiote ^3-14. L'isolement efficace des pays en développement intestinales et les macrophages est une étape cruciale pour caractériser le phénotype et la fonction de ces cellules. Alors que de nombreuses méthodes efficaces d'isoler les cellules immunitaires intestinales, y compris les pays en développement et les macrophages, ont été décrits ^6,10,15-24, beaucoup comptent sur ​​les temps des digestions longues qui peuvent influencer négativement l'expression des antigènes de surface cellulaire, la viabilité cellulaire, et / ou le rendement des cellules. Ici, nous détaillons une méthode pour l'isolement rapide d'un grand nombre de viable, les PED intestinales et les macrophages. La caractérisation phénotypique des CD intestinales et les macrophages est effectuée par coloration directe isolés cellules intestinales avec spécifiques marquées par fluorescence des anticorps monoclonaux pour l'analyse des flux multi-couleurs cytométrie. En outre, DC de haute pureté et les populations de macrophages sont isolés pour des études fonctionnelles utilisant CD11c et CD11b perles de cellules activées de tri magnétique suivi par le tri cellulaire.

Protocole

1. Dissection et dissociation des cellules épithéliales intestinales

Préparation des réactifs et du matériel:

• Chaude Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} sans PBS (FMC PBS) à la température ambiante.
• Chaud Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-libres} HBSS avec 5% de FBS (HBSS CMF / FBS) et 2 mM EDTA à température ambiante.
• Chaud Agitateur orbital à 37 ° C.

Remarque: Les étapes 1.1 à 1.7 doit être effectuée aussi rapidement que possible afin de minimiser l'étendue de la mort cellulaire et pour obtenir un rendement cellulaire maximale.

1. Eutha....

Discussion

Figure 3. Facteurs importants pour l'optimisation du rendement des cellules et l'expression des antigènes de surface. Rendement cellulaire et l'expression des antigènes de surface sont directement touchés par la durée de la digestion des tissus, les caractéristiques spécifiques de la collagénase, le degré de tissus, de hachage et la présence ou l'absence d'inflammation, ce qui peut affecter l'intégrité des tissu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
PBS 1X, Ca 2 + - et Mg 2 + sans
Hank solution saline équilibrée (HBSS) avec le rouge de phénol	Fisher Scientific	SH3001603
Le bicarbonate de sodium	Sigma	S6014
HEPES 1M en NaCl à 0,85%	Lonza	17-737E
Sérum de veau fœtal (FBS)	Atlanta biologiques	S11150H	Inactivé à la chaleur
EDTA 0,5 M (pH 8,0)	Cellgro	46-034-CI
Collagenase type VIII	Sigma	C2139
DNase I	Roche	14785000	Solution mère: 100mg/ml
Live / Dead Kit fixable Aqua Dead Cell Stain pour 405 nm d'excitation	Invitrogen	L34957	Utilisez moins 1:1000
CD45-PerCP mAb (30F11)	BD	557235	Utilisez au 1:100
CD103-PE mAb (M290)	BD	557495	Utilisez au 1:100
FcyRIII / II mAb (2.4G2)	BD	553141	Utilisez au 1:200
CD11c-APC mAb (N418)	eBioscience	17-0114-82	Utilisez au 1:100
CMH-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb	eBioscience	56-5321-82	Utilisez au 1:100
CD11b-eFluor 450mAb (M1/70)	eBioscience	48-0112-82	Utilisez au 1:200
F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8)	eBioscience	25-4801-82
CD11b microbilles	Miltenyi Biotec	130-049-601
CD11c microbilles	Miltenyi Biotec	130-052-001
Tubes de 50 ml coniques	BD Falcon	352098
Simple filtre en treillis	Chefmate
Petit bateau pèsent	Fisher Scientific	08-732-116
100 tamis cellulaire pm	BD Falcon	352360
40 tamis cellulaire pm	BD Falcon	352340
5 ml à fond rond en polystyrène tubes	BD Falcon	352235	Utilisez au 1:100
MaxQ 4450 paillasse agitateur orbital	Thermo Scientific
LS MACS colonne	Miltenyi Biotec	130-042-401
LSR II	BD
FACSAria II	BD