Article de méthode
Les circuits neuronaux sont topographiquement organisée en compartiments fonctionnels avec des profils spécifiques moléculaires. Ici, nous fournissons les étapes pratiques et techniques pour révéler la topographie du cerveau planétaire grâce à une approche polyvalente wholemount coloration immunohistochimique. Nous démontrons l'utilité de la méthode utilisant la cytoarchitecture bien compris et les circuits du cervelet.
L'architecture répétée et bien compris cellulaire du cervelet en font un système modèle idéal pour explorer la topographie du cerveau. Sous-tend son cytoarchitecture relativement uniforme est un ensemble complexe de domaines parasagittales de gène et l'expression des protéines. Le cloisonnement moléculaire du cervelet est reflétée par l'organisation anatomique et fonctionnelle des fibres afférentes. Pour apprécier pleinement la complexité de l'organisation du cervelet que nous avons déjà une approche affinée coloration wholemount pour l'analyse à haut débit de défauts de structuration dans le cervelet de souris. Ce protocole décrit en détail les réactifs, des outils, et des mesures pratiques qui sont utiles pour réussir à révéler des modèles d'expression de protéines dans le cervelet de souris adulte en utilisant immunomarquage wholemount. Les étapes mis en évidence ici démontrer l'utilité de cette méthode en utilisant l'expression de zebrinII / aldolaseC comme un exemple de la façon dont la topographie fine de la cerveau peut être révélé dans sonnatif conformation tridimensionnelle. Sont également décrits des adaptations apportées au protocole qui permet la visualisation de l'expression des protéines dans les projections afférentes et cervelets grande pour des études comparatives de la topographie moléculaire. Pour illustrer ces applications, les données de coloration afférente du cervelet de rat sont inclus.
1. Perfusion des animaux et de dissection Cervelet
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Nous avons décrit les détails techniques nécessaires pour la coloration wholemount succès en utilisant une approche polyvalente immunohistochimique pour l'expression des protéines dans le cerveau révélateur en développement et les adultes. En utilisant cette approche, des motifs complexes moléculaires d'expression peut être analysée et la topographie du cerveau apprécié sans la nécessité de laborieuses et consommatrices de temps les procédures de sectionnement des tissus.
Ce protocol.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Nous n'avons rien à communiquer.
RVS est pris en charge par l'enquêteur nouvelle fonds de démarrage d'Albert Einstein College of Medicine de l'Université Yeshiva.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Matériels | Fonction dans le protocole | ||
| Pompe à perfusion (Fisher Scientific/13-876-2) | Permet de perfusion constante et lente. | ||
| Sharp-tip Ciseaux (FST/14081-08) | Utilisation générale de la perfusion et la dissection. | ||
| Blunt-tip forceps (FST/91100-12) | Pour stabiliser le coeur pour l'insertion de l'aiguille de perfusion. | ||
| Pince (FST par Dumont AA/11210-10) | Pour utilisation lors de la dissection du cerveau du crâne et de séparer du cervelet du reste du cerveau. Ces éléments sont essentiels parce qu'ils ont une extrémité légèrement arrondie qui permet de minimiser les dommages au cervelet lors de la dissection. | ||
| Nutator (Fisher Scientific) | Utilisé pour conserver des tissus en mouvement pendant les périodes d'incubation. | ||
| Tube de 1,5 ml (Sarstedt / Vis Micro Tube) | Toutes les étapes du sontochemistry protocole ont lieu dans ces microtubes. Le fond arrondi assure que le cervelet reste en mouvement. | ||
| Cuillère perforée (FST/10370-17) | Utilisé pour conserver des échantillons entiers dans les microtubes tout en douceur décantation la solution passé. | ||
| Leica MZ16 FA microscope | Utilisé pour examiner la coloration wholemount. | ||
| Leica DFC3000 FX caméra | Utilisé pour capturer des images wholemount. |
Tableau 1.
| Calendrier Exemple pour une expérience typique wholemount | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Jour 1 | Dent de correctifs, la température ambiante, 8 heures | Dent eau de Javel, 4 ° C, durant la nuit | ||||||
| Jour 2 | 100%, MeOH température ambiante, 2x, 30 minutes chacun | 100% de MeOH, au gel / dégel, 4x, 30 min/15 min | n = "2"> 100% MeOH, -80 ° C, pendant une nuit | |||||
| Jour 3 | 50% MeOH/50% PBS, la température ambiante, 60-90 min | 15% MeOH / 85% de PBS, la température ambiante, 60-90 min | 100%, PBS température ambiante, 60-90 min | 10μg/mL protéinase K dans du PBS, la température ambiante, 2-3 min | 100%, PBS température ambiante, 3x, 10 min à chaque fois | PMT, 4 ° C, durant la nuit | ||
| Jour 4-5 | PMT + 1 ° d'anticorps + 5% DMSO, 4 ° C, 48 h | |||||||
| Jour 6 | PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 heures chaque | PMT + 2 ° anticorps + 5% de DMSO, 4 ° C, 24 heures (ou commencer étapes d'amplification avec ABC complexe) | ||||||
| Jour 7 | PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 heures chaque | PBT, la température ambiante, 2 heures | Incuber en DAB frais dans du PBS jusqu'à coloration optimale est visualisée | |||||
| Recettes (* = préparer une nouvelle à chaque fois) | |
|---|---|
| PBS (tampon phosphate salin) | 0,1 M de tampon phosphate salin dans de l'eau désionisée. pH 7,2 (Sigma comprimés; P4417) |
| PFA (paraformaldéhyde) | Fabriqué et congelés stockés comme une solution à 20%, puis on dilue à 4% dans du PBS pour la solution de travail (Fisher Scientific, T353) |
| Fixation de Dent 3 * | 4 parties de méthanol 1 diméthylsulfoxyde partie (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) |
| Dent Bleach 3 * | 4 parties de méthanol 1 diméthylsulfoxyde partie (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 partie de peroxyde d'hydrogène 30% |
| Digestion enzymatique | 10 pg / ml de protéinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) dans du PBS. |
| PBST | PBS contenant: 0,1% de Tween-20 (Fisher scientifique, BP337; Triton peut également être utilisé à la place de Tween-20 dans tous les cas). |
| PMT 25 * | PBS contenant: 2% de poudre écrémé lait écrémé (Carnation préféré) 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific, BP337) |
| PBT 25 * | PBS contenant: 0,2% de sérum albumine bovine (Sigma; B9001S) 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific, BP337) |
| DAB * | Dissoudre un comprimé de 10 mg de 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) dans 40 ml de PBS. Ajouter 10 ul de peroxyde d'hydrogène à 30% pour initier la réaction). |
| ABC solution complexe | Vectastain kit (Vector Laboratories, Inc; PK-4000) |
Tableau 3.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demander une autorisation