Profilage global de régulation de la dopamine dans la substance noire et aire tegmentale ventrale

Résumé

La dopamine est nettement réglementée dans les noyaux du mésencéphale, qui contiennent les corps cellulaires et les dendrites des neurones dopaminergiques. Nous décrivons ici une approche de dissection et manipulation d'échantillons de maximiser les résultats, et donc les conclusions et les points de vue, sur la réglementation de la dopamine dans les noyaux du mésencéphale de la substantia nigra (SN) et l'aire tegmentale ventrale (VTA) chez les rongeurs.

Résumé

La dopamine est un neurotransmetteur vigoureusement étudiée dans le SNC. En effet, son implication dans l'activité locomotrice et la récompense liée au comportement a favorisé cinq décennies d'enquête sur les carences moléculaires associés à la réglementation la dopamine. La majorité de ces demandes de régulation de la dopamine dans le cerveau sur mise au point de la base moléculaire de sa réglementation dans les régions de champ terminales des voies nigrostriataux et mesoaccumbens; striatum et le noyau accumbens. En outre, ces études se sont concentrées sur l'analyse du contenu des tissus de la dopamine avec la normalisation du poids des tissus seulement humide. Enquête sur les protéines qui régulent la dopamine, comme la tyrosine hydroxylase (TH) des protéines, la phosphorylation TH, transporteur de la dopamine (DAT), et vésiculaires transporteur de monoamines 2 (VMAT2) protéine souvent ne comprennent pas l'analyse du contenu des tissus de la dopamine dans le même échantillon. La capacité à analyser à la fois le contenu des tissus de la dopamine et de ses protéines régulatrices (y compris post-tramodifications nslational) ne donne pas seulement le pouvoir inhérent à l'interprétation de la relation de la dopamine au niveau des protéines et la fonction de TH, DAT ou VMAT2, mais s'étend également l'économie de l'échantillon. Cela se traduit par un coût moindre, tout en produisant un aperçu de la régulation moléculaire de la dopamine dans pratiquement n'importe quel paradigme de choix des enquêteurs.

Nous nous concentrons les analyses dans le mésencéphale. Bien que le SN et VTA sont généralement négligé dans la plupart des études de régulation de la dopamine, ces noyaux sont facilement disséqué avec la pratique. Une lecture complète du contenu du tissu de la dopamine et TH, DAT ou VMAT2 peut être effectuée. Il est en plein essor la littérature sur l'impact de la fonction de dopamine dans le SN et VTA sur le comportement, et les empiétements de substances exogènes ou des procédés qui y sont la maladie ^1-5. En outre, des composés tels que les facteurs de croissance ont un effet profond sur les protéines de la dopamine et la dopamine-régulation, dans une mesure relativement plus grande dans le SN ou VTA Nous allons illustrer la technique de dissection de séparer ces deux noyaux et le traitement d'échantillons de tissus disséqués qui produit un profil révélant les mécanismes moléculaires de régulation de la dopamine in vivo, spécifiques pour chaque noyaux (figure 1).

Protocole

1. Dissection

1. Sur un lit de glace humide, se détendre une matrice cerveau des rongeurs (coupes coronales séparés de 1 mm d'écart), une boîte de Pétri contenant 5 rasoirs, et d'un scalpel n ° 11. Dans un récipient séparé, étiqueté lieu tubes de 2 ml de taille microfuges dans la glace sèche.
2. L'enquêteur de choisir la méthode d'euthanasie. Nous avons des résultats reproductibles qui effectuent une anesthésie très bref avec de l'isoflurane, l'idéal, un vaporisateur doit être utilisé. Toutefois, s'il n'est pas disponible, nous utilisons un pot contenant une batterie de grande plate-forme. Avec le pot de la batterie situ....

Discussion

Comme il est indiqué dans la figure 1, les méthodes décrites ci-dessus devrait produire plusieurs lectures de la dopamine et son TH régulation des protéines, DAT, et VMAT2 d'un échantillon de SN ou VTA obtenu à partir de chez le rat ou la souris. Encore une fois, les avantages de la réalisation de ce protocole sont que l'enquêteur peut obtenir un indicateur de vue opérationnel appariés de la façon dont la dopamine est régulée in vivo dans pratiquement n'importe quel paradigme expérimental e.......

Matériaux

Système HPLC:

Le système de base se compose d'un Shimadzu LC10-ADVP pompe HPLC, un échantillon des eaux WISP 717 injecteur automatique, d'un 250 X 4,4 mm 5 microns Spherosorb ODS-1 C18 colonne en phase inverse (Waters), un Bioanalytical Systems (BAS) TL12 vitreux double électrode de carbone, deux BAS LC4B détecteurs électrochimiques, et quelques eaux Empower 2 collecte de données et système d'intégration.

La colonne est maintenue à 30-45 ° C (chauffe BAS colonne LC22A). La phase mobile est de 0,1 M de phosphate de sodium (pH 3,0), EDTA 0,1 mM, 0,2-0,4 mm 1-octane acide sulfonique (Eastman Kodak-), et de l'acétonitrile 0,35% (v / v), filtré à travers un filtre de 0,45 micron. Le débit est de 1,2 ml / min. Quatre lots litre de la phase mobile sont optimisés pour des séparations en ajustant le pH, d'acide sulfonique et d'octane température de la colonne. La phase mobile est recyclé, et est continuellement purgé avec un gaz d'hélium pour éliminer l'oxygène dissous. Le recyclage de la phase mobileest presque indispensable de maintenir une bonne résolution pour une période de temps raisonnable. La phase mobile durée de vie est maintenu par l'aide d'un détecteur de débit (contrôlé par l'intégrateur) pour détourner de perdre le premier 2-7 min de chaque course.

Les électrodes sont maintenues à des potentiels d'environ 0,78 et 0,95 V par rapport à une électrode de référence Ag/AgC1. L'électrode à la plus élevée possible est utilisé exclusivement pour la détermination de tryptophane (et de la norme interne NMDA). Le potentiel 0,78 V fournit un signal supérieure à bruit pour la détection des monoamines et des composés, autres que le tryptophane. Les chromatogrammes sont stockés sur le disque dur du poste de travail Empower, puis traitées et les données transférées directement dans un tableur Excel pour le calcul des montants de métabolites et de compilation des données du groupe.

Pompe: Shimadzu LC-10AD
Cellulaire: BAS Croix débit. Carbone vitreux électrode de travail à 0,780 et 0,950 potentiel V.
Détecteur: BAS LC-4B fonctionnant en mode dual channel.
Données Acq. Système: Waters Empower Pro 2.
Injecteur: WISP Waters 717
Colonne: Waters Spherosorb ODS-1, 5 uM de particules, 4,4 mm X 250 mm.

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	- JT Baker	4095-02
Base de Trizma	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glycérol	Sigma	G8773-500 ml
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
dPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 ml
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Bleu de bromophénol	Sigma	B8026-5G
Dithiothreitol	Sigma	D-9163
Standard Protéines 2 mg de BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A	Thermo Fisher Scientific-	23223
Precision Plus Protein standard	Bio Rad	161-0373
[125I]-protéine A, l'activité spécifique	Perkin-Elmer

Tableau 2. Réactifs spécifiques.

Réactifs	Formules
SDS à 10%	10 g de SDS, 100 ml DI H 2 0
1% (pH à 8,2) SDD	10 mlSDS à 10% 60,5 mg de base Trizma 37,22 mg d'EDTA 90 ml DI H 2 0
Solution de sulfate de cuivre II	1 Cuivre II sulfate de g 25 ml DI H 2 0
Sample Buffer 3X	Trizma Base de 2,27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0,463 g Glycérol 30 g Le bleu de bromophénol 10 mg DIH 2 0 (d'abord ajouter ci-dessus réactifs à 40 mL de H 2 0 dans une éprouvette graduée, puis ajouter H 2 0 jusqu'à ce que le volume atteint 100 ml) HCl (ajouter au besoin pour atteindre un pH de 6,85) Congeler solution dans des tubes de 50 ml 2.0. (Fait 100 ml): Volume de tampon d'échantillon nécessaire 3X = volume ½ de la SDD utilisé dans l'échantillon.
1X tampon d'échantillon	Diluer le tampon de l'échantillon jusqu'à 3X 1X tampon d'échantillon à l'aide DI H 2 0
10X Exécution de tampon (Donne 4 L)	Trizma Base de 121,1 g Glycine 577 g SDS 40 g
Tampon de transfert 10X: (Donne 4 L)	Glycine 360 ​​g Trizma Base de 96 g
Ponceau	Ponceau S de 0,5 g Acide acétique à 5 ml DI H 2 0 95 ml
0,2% Solution HCl	5,2 ml de HCl dans 500 ml de DI H 2 0
PVP-T20 blocage Soln. (Donne 4 L)	PVP-40 40 g dPBS 38,2 g Tween 20 2 g Thimerisol 0,4 g 1M Tris pH 7,6 (60,6 g de Tris HCl + 13,9 g de Tris base dans 500 ml H 2 0 DI) - 50 ml
Tampon 10X Blot (Donne 4 L)	Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris-HCl 61 g

ontenu "Protein Assay> Tableau 3. et de l'Ouest Formules buvard.

Normes de la tyrosine hydroxylase: Les calibrés TH normes de protéines et de la phosphorylation utilisés par ce laboratoire proviennent de PC12 extraits cellulaires, qui ont été analysés pour la teneur en protéines TH et stoechiométries phosphorylation contre un TH normes préalablement calibrées qui a finalement origine du laboratoire du Dr John Haycock ¹¹ .