Un protocole simple pour extraire l'hémocytes de chenilles sauvages

Résumé

Hémocytes d'insectes effectuer de nombreuses fonctions importantes, tant immunitaires et non immunitaires, à tous les stades de développement des insectes. Notre connaissance actuelle des types hémocytaires et de la fonction provient d'études sur les insectes des modèles génétiques. Ici, nous présentons une méthode pour l'extraction, la quantification et la visualisation des hémocytes des chenilles sauvages.

Résumé

Hémocytes d'insectes (l'équivalent de mammifères globules blancs) jouent un rôle important dans plusieurs processus physiologiques tout au long du cycle de vie d'un insecte ^1. Dans les stades larvaires des insectes appartenant aux ordres des lépidoptères (papillons) et des diptères (mouches vraies), les hémocytes sont formés à partir de la glande lymphatique (un organe spécialisé hématopoïétique) ou des cellules embryonnaires et peuvent être transportés jusqu'au stade adulte. Hémocytes embryonnaires sont impliqués dans la migration cellulaire au cours de règlement sur le développement et la chimiotaxie cours de l'inflammation. Ils participent également à l'apoptose des cellules et sont essentiels pour l'embryogenèse ^2. Hémocytes arbitrer le bras cellulaire de la réponse immunitaire innée des insectes qui comprend plusieurs fonctions, telles que l'agrégation cellulaire cellule propagation,, formation de nodules, la phagocytose et l'encapsulation des envahisseurs étrangers ^3. Ils sont également responsables de l'orchestration spécifiques insectes défenses humorales cours de l'infection, comme le production de peptides antimicrobiens et d'autres molécules effectrices ^{4, 5.} La morphologie et la fonction hémocytes ont été principalement étudiés dans génétiques ou physiologiques modèles d'insectes, y compris la drosophile, Drosophila melanogaster ^{6, 7,} les moustiques Aedes aegypti et Anopheles gambiae ^{8, 9} et le sphinx du tabac, Manduca sexta ^{10, 11.} Cependant, peu d'informations existent actuellement sur ​​la diversité, la classification, la morphologie et la fonction des hémocytes en espèces d'insectes non du modèle, en particulier celles recueillies auprès de ¹² sauvage.

Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour extraire les hémocytes des chenilles sauvages. Nous utilisons l'avant-dernier stade Lithacodes fasciola (papillon jaune lingot d'épaules) (figure 1) et Euclea delphinii (aiguillat chêne limace) chenilles (Lepidoptera: Limacodidae) et montrent que des volumes suffisants de l'hémolymphe (sang des insectes)On peut isoler et nombres comptés à partir de larves hémocytaires individu. Cette méthode peut être utilisée pour étudier efficacement types hémocytaires chez ces espèces, ainsi que dans d'autres chenilles de lépidoptères liées récoltées sur le terrain, ou il peut être facilement combiné avec des dosages immunologiques conçus pour étudier la fonction des hémocytes suite à une infection microbienne ou avec des organismes parasitaires ^13.

Protocole

1. Préparation des matériaux

1. Préparer aiguilles (1-2 um et pointe conique 3-4 mm) en utilisant des tubes capillaires en verre de borosilicate et un extracteur micropipette. Réglages de l'appareil: rampe: 561; vitesse: 20; chaleur: 560; retard: 1; traction: 100; pression: 500.
2. Préparer la solution de collecte: 60% de milieu de Grace (GM) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 20% de tampon anticoagulant (98 mM NaOH, 186 mM de NaCl, 1,7 mM EDTA et 41 mM d'acide citrique, pH 4,5 ). La solution ci-dessus est préparée dans des conditions stériles frais et conservés dans la glace en tout temps.
3. Préparer la solution tampon d'incubation: 90% de GM supplémenté avec 10% de FBS. Cette solution est également fraîchement préparés et conservés sur la glace en tout temps.
4. Préparer un total d'au moins 15 pi x le nombre d'insectes pour la collecte et les solutions d'incubation.

2. L'injection de chenilles avec la solution de Collection

1. Anesthésier avant-dernière inslarves de goudron en les refroidissant dans la glace pendant 20 min avant l'extraction hémocytes.
2. Adapter l'extrémité émoussée d'une aiguille propre capillaire (16-gauge) dans le tube qui est relié à une seringue 20 ml en verre (figure 2). Laisser le tube contenant la solution de collecte de s'ouvrir sur le banc du laboratoire et remplir lentement le capillaire avec le tampon. Le capillaire est généralement rempli à environ 10-15 ul de solution de collecte, en fonction de la taille de la chenille (environ 1 ul de solution par 10 mg de masse corporelle totale chenille = 0,01% de la masse corporelle totale). Reposer l'aiguille sur une boule d'argile qui est placé à côté de la loupe binoculaire.
3. Placez la chenille dans une boîte de Pétri. L'insecte doit être placé sur le côté de sorte que les stigmates sont bien visibles (figure 3).
4. Lors de l'affichage sous un microscope à dissection, maintenez la chenille en place avec une paire de pinces et placer la fermeture aiguille à l'un des stigmates, où l'encuticule secte est généralement plus doux. Appuyez doucement sur l'aiguille capillaire contre le corps de l'insecte. Une fois que l'aiguille a pénétré dans la cuticule, injecter le volume total de la solution dans la chenille (figure 3). Il est important d'éviter l'injection de bulles d'air dans la chenille. Le corps de la chenille va gonfler (par exemple, l'augmentation de volume de 20%) suite à l'injection, mais ne doit pas éclater ou suinter.
5. Retour à la chenille de la glace, le positionnement de l'insecte dorsalement tampon pour éviter toute fuite de la plaie (Figure 3).
6. Répétez les étapes 2.1 à 2.4 pour chaque chenille utilisé pour l'extraction hémolymphe. A ce stade, permettre à tous les insectes pour se détendre sur la glace pendant 30 minutes avant de continuer.

3. Extraction des hémocytes

1. Placez la chenille dans une boîte de Pétri sous la loupe binoculaire.
2. Faire un peu profonde (2-3 mm de long) incision dans la région postérieure de la chenille en utilisant un scalpe stérile l (figure 3). Prenez soin de ne pas endommager l'intestin ou d'autres organes internes, l'objectif est de percer la cuticule attentivement et de recueillir le mélange tampon / hémolymphe des insectes contenant hémocytes individuels.
3. Pressez doucement à l'aide de la chenille souple pinces en plastique tout en recueillant le mélange hémolymphe (environ 10-20 pi) avec une pipette pourboire de 10 ul, encore une fois en prenant soin de ne pas léser les tissus internes (figure 3). Hémolymphe est collectée à partir de la gouttelette pressé à partir du corps de la chenille. Jetez les restes de la chenille.
4. Recueillir hémolymphe de chaque individu chenille en différents étiquetés siliconé 0,5 ml microtubes.
5. Ajouter un volume égal de la solution d'incubation (environ 10-20 pi) pour chaque échantillon recueilli hémolymphe d'un individu chenille. Conserver les échantillons hémolymphe sur la glace en tout temps.
6. Répétez les étapes 3.1 à 3.5 pour chaque chenille utilisé dans l'expérience.

le "> 4. Quantification des hémocytes

1. Mélanger l'échantillon hémolymphe et la solution d'incubation immédiatement avant hémocytes de comptage. Ce traitement permet une séparation adéquate des hémocytes et empêche l'agglutination.
2. Utiliser un embout de pipette propre pour transférer 10 ul d'échantillon hémolymphe mélangé avec la solution d'incubation sur un hémocytomètre.
3. L'utilisation d'un microscope composé, compter et noter le nombre des hémocytes dans au moins 15 des grands carrés (superficie d'un carré: 0,04 mm ^2, profondeur: 0,1 mm) de la grille centrale de l'hémocytomètre (figure 3). Ajouter ces valeurs pour obtenir une somme totale du nombre d'hémocytes dans les cases 15.
4. Rincer le hémocytomètre et son toboggan couvert à fond en utilisant une bouteille de lavage avec de l'eau distillée et désionisée et essuyez avec Kimwipes (Kimberly-Clark) entre chaque échantillon.
5. Répétez les étapes 04.01 à 04.04 pour chaque échantillon hémolymphe.
6. Calculer le nombre moyen d'hémocytes par ml d'hémolymphe volume pour chaque chenille, comme suit:

Le volume total de chaque carré de la grille hémocytomètre: (0,04 mm ² secteur) × (0,1 mm de profondeur) = 0,004 mm ³ × 15 carrés = 0,06 mm ³ = le volume total de l'ensemble des 15 carrés pris en compte.

(Somme du nombre total des hémocytes dans les 15 carrés pris en compte / le volume total de l'ensemble des 15 carrés pris en compte) x 2 = facteur de dilution du nombre d'hémocytes / mm ³ x 1,000 = le nombre d'hémocytes / ml d'hémolymphe.

Résultats

Le protocole décrit ici permet la collecte d'un volume minimum de 10-20 ul d'hémolymphe d'insecte des chenilles individuelles. Hémocytes recueillies à l'aide de cette méthode sont libres d'agglutination cellulaire, défauts mélanisation, débris de tissus ou d'autres contaminants. Par conséquent hémocytes peuvent être facilement observés et comptés sous le microscope, et plusieurs insectes peuvent être observés dans un Hosur quelques-uns. Nous avons observé que la majorité des hémocytes dans nos échantillons étaient compo...

Discussion

Méthodes d'extraction hémocytes d'insectes d'importance médicale et les insectes lépidoptères modèle ont déjà été signalés ^{9, 14.} Méthodes d'extraction hémocytaires sont adaptées en fonction des espèces d'insectes, le stade de développement de l'insecte et de ses caractéristiques morphologiques. Par exemple, l'isolement hémolymphe de larves de Manduca peut être facilement réalisée en coupant la corne recourbée près de l'extrémité de l'abdomen ^15. Parce q...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Micropipette extracteur	Sutter Instruments	P-1000
Tubes en verre borosilicaté	Sutter Instruments	B100-50-10	OD: 1,0, ID: 0,50 mm
Grâce à moyen	Sigma	G8142
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SH3007102	Inactivé par la chaleur
Dumont # 5 forceps	Outils des sciences Beaux-	11252-40
Neubauer hémocytomètre	Hausser scientifique	3200
Plastique tubing	Tri-Tech	TT-3-32OD	OD: 3/32'', ID: 1/32 "
Verre médical seringue	Fortuna Optima	D-97877	Un volume de 50 ml
Aiguille extrémité émoussée	Petites pièces	NE-162PL-25	Calibre 16 x 1 "Longueur