Protéines de liaison de glace (IBP), également appelées protéines antigel, inhiber la croissance de la glace et sont un additif prometteur pour une utilisation dans la cryoconservation des tissus. Le principal outil utilisé pour étudier IBP est le osmomètre nanolitre. Nous avons développé une maison conçue étape de refroidissement monté sur un microscope optique et contrôlé à l'aide d'une routine sur mesure LabVIEW. L'osmomètre nanolitre décrit ici manipulé la température de l'échantillon d'une manière ultra-sensible.
Article de méthode
LabVIEW fonctionnant Osmomètre nanolitre Novel des enquêtes de glace Binding Protein
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les protéines liant la glace (PLG), notamment les protéines antigel, les protéines structurantes la glace, les protéines induisant une hystérésis thermique et les protéines inhibant la recristallisation de la glace, sont présentes chez les organismes adaptés au froid et les protègent des lésions dues au gel en interagissant avec les cristaux de glace. On trouve des PLG chez une grande variété d'organismes, notamment les poissons1, les plantes2, 3, les arthropodes4, 5, les champignons6 et les bactéries7. Les PLG s'adsorbent à la surface des cristaux de glace et empêchent les molécules d'eau de s'intégrer au réseau cristallin à l'endroit où elles sont adsorbées. La glace qui se développe entre les PLG adsorbées sur la surface du cristal adopte une forte courbure, ce qui abaisse la température à laquelle les cristaux de glace peuvent croître, un phénomène connu sous le nom d'effet Gibbs-Thomson. Cette dépression crée un écart (hystérésis thermique, HT) entre le point de fusion et le point de congélation hors équilibre, dans lequel la croissance de la glace est arrêtée8-10, voir Figure 1. L'un des principaux outils utilisés dans la recherche sur les PLG est l'osmomètre nanolitre, qui permet de mesurer l'activité d'hystérésis thermique des solutions de PLG. Des osmomètres nanolitre, tels que l'appareil Clifton (Clifton Technical Physics, Hartford, NY) et l'appareil Otago (Otago Osmometers, Dunedin, Nouvelle-Zélande), ont été conçus pour mesurer l'osmolarité d'une solution en évaluant la dépression du point de fusion de gouttelettes de volume nanolitre. Ces dispositifs ont été utilisés pour mesurer l'osmolarité d'échantillons biologiques, comme les larmes11, et se sont révélés utiles dans la recherche sur les PLG. Le contrôle manuel de ces osmomètres nanolitre limitait les possibilités expérimentales. Les variations de vitesse de température ne pouvaient pas être contrôlées de façon fiable, la plage de température de l'appareil Clifton était limitée à 4 000 mOsmol (environ -7,5 °C), et l'enregistrement de la température en fonction du temps n'était pas disponible sur ces instruments.
Nous avons conçu un système personnalisé d'osmomètre nanolitre commandé par ordinateur en utilisant une plateforme LabVIEW (National Instruments). Le plateau froid, décrit précédemment9, 10, comprend un bloc métallique à travers lequel circule de l'eau, fonctionnant ainsi comme un dissipateur thermique, voir Figure 2. Des refroidisseurs thermoélectriques sont fixés à ce bloc et peuvent être pilotés à l'aide d'un contrôleur de température commercial pouvant être commandé via des modules LabVIEW, voir Figure 3. D'autres détails sont fournis ci-dessous. Le principal avantage de ce système réside dans sa régulation de température sensible, voir Figure 4. La commande automatisée de la température permet de synchroniser une rampe de température fixe avec une sortie de microscopie vidéo contenant des détails expérimentaux supplémentaires.
Pour étudier la dépendance temporelle de l'activité de surfusion (TH), nous avons testé une IBP hyperactive de 58 kDa provenant de la bactérie antarctique Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. Cette protéine était marquée par des protéines fluorescentes vertes améliorées (eGFP) dans un vecteur conçu par le groupe de Peter Davies (Université Queen's)10. Nous avons montré que le profil de variation de température influençait l'activité de surfusion. Un excellent contrôle du profil thermique dans ces expériences a considérablement amélioré les mesures de surfusion. L'osmomètre nanolitre nous a en outre permis d'évaluer l'inhibition de la recristallisation par les IBP5, 13. En général, la recristallisation est un phénomène par lequel de gros cristaux augmentent de taille aux dépens des petits cristaux. Les IBP inhibent efficacement la recristallisation, même à faible concentration14, 15. Nous avons utilisé notre osmomètre contrôlé par LabVIEW pour suivre quantitativement la recristallisation de la glace et maintenir une fraction de glace constante grâce à une analyse vidéo en temps réel des images et à une rétroaction thermique en provenance de la chambre d'échantillonnage13. Les calculs en temps réel offrent des options de contrôle supplémentaires pendant le déroulement d'une expérience. Un support destiné à un microscope inversé a été conçu pour accueillir des dispositifs microfluidiques sous contrôle thermique, qui seront décrits ailleurs16.
Le système de plateau froid
L'ensemble de la platine froide (Figure 2) comprend un ensemble de refroidisseurs thermoélectriques qui refroidissent une plaque de cuivre. La chaleur est évacuée de la platine par la circulation d'eau froide dans un compartiment fermé situé sous les refroidisseurs thermoélectriques. Un trou de 4 mm de diamètre au centre de la plaque de cuivre sert de fenêtre d'observation. Un trou de 1 mm de diamètre a été percé dans le plan pour accueillir le thermistance. Un disque en cuivre sur mesure (7 mm de diamètre) comportant plusieurs trous (500 μm de diamètre) a été placé sur la plaque de cuivre et aligné avec la fenêtre d'observation. De l'air a été injecté à un débit de 35 ml/s et asséché à l'aide de Drierite (W.A. Hammond). L'air sec a été utilisé afin d'assurer un environnement sec au niveau de la platine de refroidissement. La platine était reliée, via une prise de sortie à 9 broches, à un régulateur de température (modèle 3040 ou 3150, Newport Corporation, Irvine, Californie, États-Unis). Le régulateur de température était connecté par un câble à une carte GPIB-PCI d'ordinateur (National Instruments, Austin, Texas, États-Unis).
Protocole
0. Procédures préliminaires
- Capillaire en verre pour injection de solution. Aide d'un extracteur capillaire (Narishige, Tokyo, Japon), préparer une pipette marquée avec une ouverture bien à partir d'un tube de verre capillaire micro (Marque GMBH, Wertheim, Allemagne). La taille de l'ouverture doit être vérifiée par le passage d'air à travers le capillaire d'obtenir bulles fines à l'eau claire. Si le capillaire est fermé, alors on peut l'ouvrir en brisant son bord. Cela peut être accompli en appuyant sur ou de la rayer doucement contre l'eau contenant parois du tube. Préparer le capillaire telle que l'ouverture est pratiquement bloquée, mais est suffisamment ouvert pour permettre la formation de bulles sous-millimétriques.
- Nettoyage disque de cuivre. Soniquer les disques de cuivre pendant 10 min dans 0,1% Micro-90 savon (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), puis laver avec de l'eau bidistillée. Introduire les disques dans un mélange isopropanol solution (technique) et soniquer à nouveau pendant 10 min. Nageoireallié, sécher les disques à l'aide de l'air filtré. Cette étape de nettoyage est essentiel pour éviter la contamination IBP entre les expériences.
- Assemblage lamelle double couche. Un assemblage lamelle a été préparé pour permettre une observation de l'échantillon, sans condensation de l'humidité sur la surface du verre de couverture. Ceci a été réalisé en plaçant un Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, Etats-Unis) de particules (2 mm de diamètre) entre deux lamelles qui ont ensuite été collés avec un pistolet à colle chaude. Cette configuration empêche la condensation qui pourrait bloquer la vue lorsque l'échantillon a été refroidi à des températures basses et supprimé la nécessité de souffler de l'air sec sur la fenêtre d'observation.
1. Phase de refroidissement Set-up
- Connectez l'entrée du flux de l'eau et de sortie de l'étape de refroidissement à 4 mm de diamètre intérieur des tubes Tygon (Saint-Gobain, Paris, France), et connecter le tube d'entrée du débit d'eau à une pompe à eau.
- Connecter un tube intérieur 4 mm de diamètre Tygon à l'entrée de l'étage de refroidissement to fournir de l'air sec. L'air est séché en utilisant une colonne en ligne Drierite.
- Actionner les pompes à air et de l'eau. Notez que les éléments de refroidissement ne doit pas être exécuté sans un dissipateur de chaleur.
- Allumez le régulateur de température, appareil photo, et la routine LabVIEW.
2. Préparation des échantillons
- Placez une goutte de 4.3 pi d'huile d'immersion B (Cargille laboratoires, Cedar Grove, New Jersey, Etats-Unis) sur la face arrière d'un disque de cuivre de diamètre 7 mm avec 500 trous forés pm à travers le disque.
- Placez le disque de cuivre sur la scène de refroidissement avec le côté huile d'immersion vers le bas.
- Raccorder le tube capillaire (le bord émoussé) pour un diamètre de 0,7 mm Tygon tube intérieur relié à l'autre extrémité sur une seringue 2 ml en verre (Poulten-Graf, Wertheim, Allemagne).
- Avant d'utiliser le tube capillaire, vérifier la petite ouverture du capillaire de sorte que l'ouverture est d'une taille appropriée (voir les procédures préliminaires).
- Insérez lentement la glaart capillaire dans le tube d'échantillon préparé IBP protéines (2,4 uM Mp IBP-GFP dans 20 mM de CaCl2 et 25 mM de Tris-HCl à pH 8, voir la référence 10 pour les détails de préparation) et retirer la seringue en verre jusqu'à ce que le capillaire en verre contient 0,1 pl de la solution de protéine.
- Commencez l'enregistrement vidéo via le logiciel LabVIEW.
- Insérer la pointe dans le capillaire en verre (contenant la solution de protéine) dans l'un des trous dans le disque de cuivre sur l'étage de refroidissement.
- Tout en observant au microscope (Olympus, Tokyo, Japon, objectif 10x), soigneusement pénétrer dans la couche d'huile d'immersion avec la pointe capillaire en verre, puis appuyez sur la seringue en verre (très délicatement) afin de fournir une petite quantité (environ 10 nl) de la protéine solution pour créer une gouttelette à 200 um.
- Couvrez le trou dans la phase de refroidissement avec l'ensemble lamelle double couche (voir les procédures préliminaires).
3. Mesure de l'activité TH
- Préss sur le bouton de refroidissement et régler la température à -40 ° C.
- Initialement, la gouttelette solution doit être limpide. A basse température, typiquement dans la gamme -30 ° C à -35 ° C, la couleur des gouttelettes changements, ce qui indique que la solution a été congelé. Immédiatement après le prélèvement a gelé, augmenter la température lentement jusqu'à ce que la glace commence à fondre en vrac. Une augmentation progressive de la température est nécessaire pour éviter le dépassement de la température qui pourrait se traduire par la fusion complète de l'échantillon.
- Basculer vers un objectif 50x et commencer à faire fondre la glace en réglant la température. Ce réglage est interactif, et les étapes finales sont généralement effectuées à l'aide des mesures de température petits de 0,002 ° C. Continuer à faire fondre jusqu'à ce qu'un monocristal reste. La taille finale du cristal doit être d'environ 10 um. La plus haute température à laquelle la fusion a cessé est déterminé comme étant le point de fusion est déterminé avec précision et dans l'étape d'analyse vidéo plus tard.
- Régler la température à quelques centièmes de degré Celsius en dessous du point de fusion du cristal et de commencer une rampe de température avec un retard de 10 min. Ajuster le taux de rampe comme vous le souhaitez. Pendant ce temps, le cristal sera exposée aux IBP.
- À la fin du temps de 10 min d'exposition, la température diminuera automatiquement sous le contrôle de la routine LabVIEW.
- Observer la forme cristalline que la température diminue. À un certain moment, l'explosion soudaine du cristal de glace peuvent être observés. La température à laquelle cela se produit est à noter que la température éclat de cristal.
- Utiliser l'analyse vidéo afin de déterminer le point de fusion et la température exacte d'éclatement. Tout d'abord, en utilisant l'analyse vidéo, trouver le point de fusion précis. Rappelons que la plus haute température à laquelle la fusion a cessé est déterminé comme étant le point de fusion. Documentez ce point de fusion dans un tableur. Ensuite, déterminer la température du cristal précise rafale, et documenter cette valeurainsi. La différence entre le point de fusion et le point de congélation, ou la température éclatement de cristal, est l'activité d'hystérésis thermique de la solution IBP.
4. Mesure de l'activité TH en fonction du temps
- Suivre le protocole décrit dans les sections 3.1 à 3.3 pour préparer un monocristal de glace.
- Après la formation de la glace, le temps de retard de la rampe comme vous le souhaitez, et tourner sur la rampe.
- La température sera réduite à un taux fixe (en fonction des besoins des opérateurs) automatiquement une fois le temps de retard rampe est passée.
- Documenter la température à laquelle se produit la rupture de cristal. Calculer le temps d'exposition (le temps entre la formation des cristaux et la salve de cristal).
- Répéter l'expérience pour divers temps de retard et tracer l'activité TH en fonction de la durée d'exposition pour évaluer la dépendance temporelle de l'activité TH.
Résultats
Mesure de la dépendance temporelle TH
L'osmomètre nanolitre LabVIEW fonctionnant facilite l'exécution des mesures précises de l'activité TH. Le taux de réduction à température constante permet la mesure de la dépendance temporelle TH. Le contrôle précis de la température activée par l'osmomètre nanolitre était crucial pour ces expériences. Le temps d'exposition d'un cristal de glace à l'IBP en solution est définie comme étant la période de temps à partir de la formation de la glace (la fin du processus de fusion) jusqu'à ce que la croissance brusque de la glace autour du cristal (cristaux rafale). Nous avons constaté que le temps d'exposition des cristaux de glace à l'IBP cruciale affecté l'activité TH. De courtes périodes d'exposition IBP (quelques secondes) produit une activité TH bas dans le Mp IBP-GFP solution (2,4 uM) (Figure 5). L'activité TH augmente avec le temps d'exposition IBP jusqu'à ce qu'il atteigne un plateau à 4 min IBP exposition. À des concentrations plus élevées IBP, la plaqueau a été atteint à des temps plus courts.
IBP Figure 1. Schéma illustrant adsorbé sur de la glace. Adoptée avec la permission de 10.
Figure 2. L'étape de refroidissement. A) reliés à des tubes sur le microscope. B) Sans plomb supérieure. Schéma C).
Figure 3. Capture d'écran de l'interface de LabVIEW. Click ici pour agrandir la figure.
Figure 4. Graphique Stabilité de la température. Le régulateur de température a été fixé pour abaisser la température de 0,01 ° C toutes les 15 secondes.
Figure 5. Activité Mp TH IBP en fonction du temps d'exposition pour les cristaux de glace IBP. Chaque point est la moyenne de temps de 3-6 expériences.
Discussion
Ce travail démontre le fonctionnement d'un osmomètre nanolitre commandé par ordinateur qui permet des mesures précises de l'activité TH avec contrôle de la température extraordinaire. Dans tout système sensible à la température, les gradients de température indésirables doivent être évitées. Afin d'éviter des gradients de température dans l'appareil présenté ici, la gouttelette de solution d'essai doit être positionné au centre d'un trou dans la phase de refroidissement en cuivre disque (étape 2,7). En outre, le cristal unique devrait être au centre de la goutte plutôt que près des bords (dans la plupart des cas, cela se produira spontanément). La dépendance temporelle décrite indique que la vitesse de refroidissement peuvent influencer les lectures TH. Ainsi, on propose notamment un rapport de la durée pendant laquelle le cristal a été exposée à la solution avant le refroidissement, ainsi que la vitesse de refroidissement. En général, nous a attendu 10 minutes avant de la décélération de la température de 0,01 ° C chaque étapes 4 sec.
Les co-contrôlées LabVIEWOling étape a été adapté pour être utilisé avec un microscope inversé sur lequel des dispositifs microfluidiques peuvent être manipulés thermiquement. Ce système facilite la réalisation d'expériences d'échange de solutions impliquant des cristaux de glace et IBPS taggés avec eGFP 9, 10, 16. Le système à commande LabVIEW peut être adapté à un stade Clifton en connectant le contrôleur de température 3040 par l'intermédiaire d'un circuit électrique désigné adaptation. Un tel système est utilisé dans le laboratoire Davies 17. Le logiciel LabVIEW et l'adaptation désigné conception de circuit électrique pour la phase de Clifton sont disponibles sur demande.
En conclusion, nous décrivons un osmomètre nanolitre qui facilite le contrôle et la manipulation sensible de la température et le taux d'augmentation de la température et une diminution (avec 0,002 ° C de sensibilité), en coordination avec une interface vidéo à travers une routine LabVIEW pour analyse en temps réel. Ce système peut effectuer reproductibles taux contrôlées par des expériences qui sont important pour enquêter sur la cinétique des interactions IBP avec de la glace. De telles expériences peuvent répondre à plusieurs questions débattues à long entourant le mécanisme d'action de IBP.
Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Cette recherche a été financée par l'ISF, la NSF, et l'ERC. Nous tenons à souligner l'aide technique avec le niveau de température de Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer, et Jeremy Dennison. Assistance au développement de logiciels ont été fournis par Ou Chen, Xu Di, Rajesh Sannareddy, et Sumit Bhattachary. Nous tenons à remercier nos collaborateurs Prof Peter L. Davies et Dr Laurie A. Graham pour la protéine de fusion IBP et des discussions utiles. Nous remercions également les membres de laboratoire Dr. Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, le Dr Yeliz Celik, le Dr Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy, et Guy Shlomit pour leur rétroaction des utilisateurs.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue / modèle | Commentaires |
| Huile à immersion de type B | Laboratoires Cargille | 16484 | |
| Drierite | WA Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro solution de nettoyage 90 | Cole-Parmer | EW-18100-11 | |
| Capillaire extracteur | Narishige | PB-7 | |
| Tubes capillaires en verre | Marque GNBH | 7493 21 | 75 mm de long, 1,15 de diamètre |
| Températurecontrôleur | Newport, Irvine, Californie, États-Unis | Modèle 3040 | Modèle 3040 |
| Microscope optique | Olympe | Modèle BH2 | |
| Objectif 10x | Olympe | S Plan de 10, 0,3, 160/0.17 | |
| Objectif 50x | Nikon | CF plan, 50X/0.55 PEV ELWD | |
| Caméra CCD | Provideo | CVC-140 | |
| Tubes Tygon | Saint-Gobain, Paris, France | Formulation Tygon S-50-HL tubes | |
| Seringue en verre (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Allemagne | 7 10227 | |
| GPIB-PCI | National Instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Vidéo cadre grabBER IMAQ PCI-1407- | National Instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| Logiciel LabVIEW System Design | National Instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| Logiciel DivX Author | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
Références
- DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
- Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
- Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
- Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
- Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
- Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
- Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
- Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
- Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
- Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
- Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
- Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
- Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).
Réimpressions et autorisations
