Différencier les rôles fonctionnels de l'expression des gènes de cellules immunitaires et non immunitaires dans l'intestin de souris par greffe de moelle osseuse

Résumé

La greffe de moelle osseuse fournit un moyen de changer le génotype des cellules de moelle osseuse dérivées. Si le gène d'intérêt est exprimé dans les deux cellules de moelle osseuse et les cellules dérivées de moelle osseuse non dérivés, la greffe de moelle osseuse peut modifier les cellules de moelle osseuse provenant d'un génotype différent sans modifier le génotype non-cellulaire de la moelle osseuse extraite.

Résumé

Pour comprendre le rôle d'un gène dans le développement de la colite, nous avons comparé les réponses des souris de type sauvage et sur les gènes d'intérêts souris knockout déficientes à la colite. Si le gène d'intérêt est exprimé dans les deux cellules de moelle osseuse et de cellules dérivées de moelle osseuse non dérivés de l'hôte, mais il est possible de différencier le rôle d'un gène d'intérêt dans des cellules de moelle osseuse dérivées et non de la moelle osseuse des cellules dérivées de la technique de transplantation de moelle osseuse. Pour changer la moelle osseuse de cellules dérivées du génotype des souris, la moelle osseuse d'origine des souris receveuses ont été détruites par l'irradiation, puis remplacé par un nouvel os moelle du donneur du génotype différent. Lorsque de type sauvage moelle osseuse du donneur souris a été transplanté à des souris knock-out, nous avons pu générer des souris knock-out avec l'expression du gène de type sauvage dans des cellules de moelle osseuse dérivées. Alternativement, lorsque les souris knock-out moelle osseuse du donneur a été transplanté à des souris de type sauvage bénéficiaires, souris de type sauvage sans gène d'intérêt exprimantde la moelle osseuse des cellules dérivées ont été produites. Cependant, la greffe de moelle osseuse peut ne pas être 100% complet. Par conséquent, nous avons utilisé cluster de différenciation (CD) molécules (CD45.1 et CD45.2) comme marqueurs de cellules du donneur et du receveur de suivi de la proportion de cellules de moelle osseuse du donneur provenant de souris receveuses et la réussite de la greffe de moelle osseuse. Souris de type sauvage avec des souris knock-out et génotype CD45.1 avec CD45.2 génotype ont été utilisés. Après l'irradiation des souris receveuses, les cellules du donneur de moelle osseuse de différents génotypes ont été infusée dans les souris receveuses. Lorsque la moelle osseuse nouvelle régénérée pour reprendre son immunité, les souris ont été provoquées par un agent chimique (sulfate de sodium dextrane, le MAS 5%) pour induire une colite. Ici, nous avons également montré la méthode pour induire une colite chez la souris et d'évaluer le rôle du gène d'intérêt exprimé à partir de la moelle osseuse des cellules dérivées. Si le gène d'intérêt dans les cellules osseuses dérivées joue un rôle important dans le développement de la maladie (comme Escherichiatis), le phénotype des souris receveuses avec greffe de moelle osseuse peut être significativement modifiée. À la fin des expériences colite, la moelle osseuse de cellules dérivées dans le sang et la moelle osseuse ont été marquées avec des anticorps contre CD45.1 et CD45.2 et leur rapport quantitatif de l'existence pourrait être utilisée pour évaluer la réussite de la greffe de moelle osseuse par cytométrie en flux. Succès de la transplantation de moelle osseuse doit montrer une grande majorité de génotype donneur (en terme de marqueur molécule CD) sur le génotype destinataire à la fois dans la moelle osseuse et le sang des souris receveuses.

Protocole

1. Avant-vous-start Considérations techniques

1. Nous vous recommandons d'utiliser les deux C57/BL6 souris de type sauvage et des souris knock-out pour l'expérience parce que les souris avec des molécules CD correspondantes peuvent être achetés auprès de fournisseurs majeurs de souris.
2. Comme il est difficile de suivre les souris de type sauvage et des souris knock-out dérivées des cellules du donneur après transplantation de moelle osseuse, il est nécessaire d'utiliser des souris CD45.1 pour représenter souris de type sauvage. (CD45.1 C57/SJL WT souris Jackson Laboratories stock # 002014).
3. La plupart des colonies de souris sont CD45.2. Nos souris knock-out appartiennent à CD45.2 génotype (encore un CD45.2 source de souris WT: Jackson Laboratories stock # 000664). La détermination du génotype CD45.1 ou CD45.2 peut être effectuée en utilisant la cytométrie en flux de moelle osseuse et le sang périphérique tel que mentionné à l'article 7 du présent protocole.
4. Souris après irradiation ont un système immunitaire fragilisé. Gardez souris dans usine exempte de pathogène.
5. Opération de irradiateur nécessite spécial de sécurité clearance et de la formation. Pour gagner du temps dans les processus de formation et d'agrément, il est préférable de collaborer avec un laboratoire technicien qualifié qui est en mesure d'opérer l'irradiateur.
6. De nombreuses institutions ont des laboratoires de cytométrie de flux avec des techniciens expérimentés. Afin de minimiser les problèmes de fonctionnement cytométrie en flux, il est préférable de discuter de votre plan d'expérience cytométrie de flux avec le technicien expérimenté avant de commencer.
7. Les souris ont été affectés de cette manière (10 souris par groupe):

Groupe		Donneur de moelle osseuse au destinataire	Traitement
A	BM échange	WT CD45.1 à CD45.2 KO	DSS colite
B			Maîtrise de l'eau normale
C	BM échange	CD45.2 KO à CD45.1 WT	DSS colite
D			Maîtrise de l'eau normale
E	Comédie	CD45.1 WT à WT CD45.1	DSS colite
Fa			Maîtrise de l'eau normale
Sol	Comédie	CD45.2 KO KO CD45.2	DSS colite
H			Maîtrise de l'eau normale

* Une brève illustration du protocole expérimental est représenté sur la figure 1.

2. Bénéficiaire souris irradiation

1. Les souris sont élevés et maintenus exempts d'organismes pathogènes dans l'installation. Placez la souris à tarte irradiation autoclave avec filtre. Placer une souris dans chaque fente de tarte irradiation. Placez la tarte dans l'irradiateur et assurez-vous que le plateau tournant et se tournent tarte.
2. Mettez la pompe à airpour la ventilation. Fermez la porte d'irradiation et le verrouiller.
3. Irradier les souris avec 1.000 rad (ce qui équivaut à 10 Gy) environ 10 min (selon la source de rayonnement et la demi-vie). De ce point du temps, les souris irradiées sont immuno-déprimés et ont leur faible immunité contre l'infection. Après irradiation, prendre la tarte et placer dans un contenant stérile pour le transport d'enceinte de sécurité biologique dans l'animalerie. Évitez d'exposer les souris à l'environnement externe pour réduire les risques d'infection.
4. En enceinte de sécurité biologique, de transférer les souris dans des cages de souris autoclave autoclave avec literie (4 souris par cage Ajouter une nouvelle eau stérile avec suspension Sulfatrim -. 3,12 ml par 100 ml d'eau).
5. Envelopper la bouteille d'eau avec du papier aluminium que les antibiotiques sont sensibles à la lumière. Secouez pour mélanger le flacon de solution Sulfatrim avant de la charger dans la cage.

3. Extraction Os Marrow Donor

1. Sacrifier des souris avec du dioxyde de carbone ou isoflurment et puis plonger dans la solution de Lysol 1:200. Vaporiser les souris avec de l'éthanol à 70% pour mouiller la peau et les os disséquer ouverts.
2. Faire tremper les instruments de dissection dans l'éthanol à 70% pour la stérilisation.
3. La dissection dans une enceinte de sécurité biologique. Utiliser les instruments de dissection stériles pour exposer l'humérus, le fémur, le tibia et du péroné os, libre de se fixer des muscles et des ligaments.
4. Couper les deux extrémités des os pour montrer la moelle osseuse rouge. Maintenir les os avec une pince. Rincer la moelle osseuse rouge avec du PBS froid avec une seringue de 3 ml et des aiguilles de 25 G sur une boîte de Pétri. Rincer à partir des deux extrémités des os pour obtenir des cellules de moelle osseuse plus.
5. Utilisez 6 seringues ml et 18G1 / 2 aiguilles pour briser les bouchons rouges par la moelle osseuse des ponctions répétées et d'éjection. Transfert de moelle osseuse avec tubes Falcon de 50 ml.
6. Faites tourner la moelle osseuse dans 1800 rpm pendant 5 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant, resuspendre le culot par vortex pendant 5-10 secondes.
7. Diluer 10X tampon de lyse RBC avec de l'eau stérile. Annonced 1X tampon de lyse des globules rouges (5 ml par souris donneuse), vortex à nouveau pendant 5 sec et garder exactement 3 min à température ambiante.
8. Après 3 minutes, remplir les tubes avec 20 ml de PBS froid pour arrêter la lyse et mélanger. Verser le contenu dans une passoire cellule 40 um directement dans un nouveau tube Falcon de 50 ml.
9. Rincer les tubes d'origine avec 5 ml de PBS et transférer à tamis cellulaire ainsi. Compléter à 50 ml avec du PBS et mélanger.

4. Compter les cellules donneurs de moelle osseuse

1. Ajouter 100 ul de bleu trypan dans un tube Eppendorf et 100 pi de suspension de moelle osseuse dans un tube Eppendorf et mélanger. Introduire à la pipette le mélange de cellules colorées à un hémocytomètre.
2. La quantité de cellules est calculé en nombre d'os habitable totale de moelle de cellules dans des tubes Falcon = nombre de cellules non colorées en 16 carrés x 2 (en raison de bleu trypan dilution) x 10.000 x 50 ml
3. Centrifuger les cellules de moelle osseuse de tubes Falcon de 50 ml à 2.000 tours par minute pendant 5 min à 4 ° C.
4. Enlever le surnageant. Basésur les numérations cellulaires totales, remettre en suspension le culot dans du PBS à 1 x 10 ⁸ cellules par ml

5. Infusion de souris receveuses

1. Réchauffez les souris receveuses sur un pad thermique et sous une lampe chauffante. Mettez les souris receveuses dans restrainer. Injecter 1 x 10 ⁷ cellules par souris dans 100-200 ul par voie intraveineuse.
2. L'injection de moelle osseuse du donneur doit être effectuée entre 4-24 heures après l'irradiation.
3. Restez à 4 souris injectées par cage. Maintenir les souris receveuses injectés dans des cages en autoclave avec de l'eau traitée par les antibiotiques pour les 4 premières semaines de l'animalerie exempte de pathogènes et de laisser les souris reprendre l'immunité. Changement des cages, traités aux antibiotiques eau et de la nourriture tous les 4 jours pour maintenir l'hygiène.

6. L'induction de la colite et de l'évaluation de la colite

1. 4 semaines après la greffe de moelle osseuse et d'irradiation, passer à l'eau ordinaire, sans antibiotiques et maintenir la souris pour 2 semaines de plus pour reprendre leurs activités normalesflore microbienne intestinale.
2. 6 semaines après l'injection de moelle osseuse, de mesurer le poids corporel initial. Certaines souris sont donnés 5% de sulfate de dextrane à boire l'eau ad libitum pour induire la colite. Certaines souris reçoivent de l'eau potable régulier seulement que les groupes de contrôle normaux.
3. 5 jours plus tard, retirer le sang périphérique, transfert à l'héparine tubes revêtus (Vacutainer) et conserver dans la glace. Piscine du sang à partir de 4 souris à 1 tube. Mélanger 300 ul de sang avec 300 pi de tampon de coloration cellulaire = 600 pi. Diviser le sang de 5 tubes Eppendorf, chacun avec 100 pi.
4. Sacrifier les souris avec du dioxyde de carbone ou de l'isoflurane. Évaluer les scores des dommages macroscopiques (s'il vous plaît se référer à une autre publication JOVE vidéo pour plus de détails ^1). Mesurer changement de poids corporel. Longueur et l'épaisseur de l'intestin mesure avec pied à coulisse numérique. Observez la texture des selles (dur, mou ou sanglante). Déterminer sang occulte dans les selles avec Hemooccult. Disséquer les tissus du côlon et de fixer dans le formol pour H & E coloration.
5. Disséquer une bo fémurne par souris, extraire la moelle osseuse et rincer la moelle osseuse avec du PBS froid via une aiguille 25G et seringue de 1 ml. Moelle osseuse Poule 4 bouchons pour 1 tube et garder dans la glace.
6. Verser la moelle osseuse à une boîte de Pétri, la prise de cisaillement moelle osseuse avec une aiguille 18G et 5 fois la seringue jusqu'à plusieurs ml sans prise de moelle osseuse est présente.
7. Isoler avec 1500 rpm pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension avec 600 ul de tampon de cellule coloration. Diviser la moelle osseuse remis en suspension à 5 tubes Eppendorf, chacun avec 100 pi.

7. Contrôle de qualité de la transplantation de moelle osseuse par cytométrie en flux

1. Étiquetez chaque tubes de prélèvement de sang ou de moelle osseuse # 1-5:
2. Préparer le mélange d'anticorps pour chaque tube respectif dans l'obscurité.

N ° 1 Aucun anticorps
# 2 30 ul de contrôle isotype FITC + 30 pl PE isotype contrôle + 15 pl CD16/32 blocage
# 3 30 ul FITC CD45.1 Ab + 15 pl CD16/32 blocage
# 4 30 ul PECD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blocage
# 5 30 ul FITC CD45.1 Ab + 30 ul PE CD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blocage

Ajouter à rien échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 1

Ajouter 5 ul de mélange d'anticorps n ° 2 à chaque échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 2

Ajouter 3 pi de mélange d'anticorps n ° 3 à chaque échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 3

Ajouter 3 pi de mélange d'anticorps n ° 4 à chaque échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 4

Ajouter 5 ul de N ° 5 mélange d'anticorps à chaque échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 5

3. Gardez à l'foncée de la glace pendant 30 min.
4. Ajouter 2 ml de tampon de lyse 1X RBC dans chaque tube. Conserver dans l'obscurité sur la glace pendant 15 min.
5. Centrifuger les cellules à 1500 rpm, 5 min à 4 ° C. (GH 3.8 rotor, 1500 rpm = 350 xg) Retirer le surnageant. Reprendre le culot avec 500 ul de tampon de cellule coloration dans l'obscurité, puis brièvement vortex.
6. Vérifier la CD45.1 (représentant WT) et CD45.2 (représentant KO) dans le sang et immunocolorées échantillons de moelle osseuse par cytométrie de flux. Sélectionnez FITC pour représenter WT CD45.1 et PE pour représenter KO CD45.2.
7. Analyser les résultats de cytométrie en flux par le logiciel FlowJo. Calculer le rapport de FITC: PE ou PE rapport: rapport FITC pour déterminer si le génotype donneur est génotype dominant dans le sang et la moelle osseuse.

Résultats

Si le gène d'intérêt joue un rôle important dans les cellules immunitaires au cours du développement de la colite, les souris recevant la moelle osseuse de génotype différent par greffe de moelle osseuse (WT KO ou KO à WT) devrait avoir une altération de la réponse à la colite DSS. L'un des paramètres les plus importants pour déterminer la gravité de la colite est la coloration H & E des tissus coliques. Changements dans la structure des tissus du côlon et des signes d'inflammation peut être évaluée quantitativement...

Discussion

Cette approche greffe de moelle osseuse est adapté à la recherche d'immunologie de la colite, une infection, le cancer, l'obésité et d'autres maladies. Cette expérience greffe de moelle osseuse est nécessaire lorsque le gène d'intérêt est exprimé à la fois dans la moelle osseuse dérivées et les cellules de moelle osseuse non dérivés et le gène d'intérêt est soupçonnée de servir de médiateur maladie par les cellules de la population soit. Par exemple, peptide antimicrobien cathélicidine est montré à m...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Tampon de coloration cellulaire	BioLegend	# 420201
10X tampon de lyse RBC	BioLegend	# 420301
FITC de souris isotype contrôle	BioLegend	# 400207
PE souris isotype contrôle	BioLegend	# 400211
PE anti-souris CD45.2	BioLegend	# 109807
FITC anti-souris CD45.1	BioLegend	# 110705
Anti-blocage souris CD16/32	BioLegend	# 101301
40 um tamis cellulaire	Fisherbrand	# 22363547
PBS 1X	MP Biomédical	# 1860454
L'héparine	Fisherbrand	# BP2425
Sulfatrim (SMZ)	Qualitest	NC9242720 (pêcheur)
Lysol IC	Andwin scientifique	NC9745686 (pêcheur)
Vaccutainer	BD	# 8000813
Souris restrainer	Braintree scientifique	# TV-150
Irradiateur	JL Shepherd and Associates	Mark I 68A
Cytomètre en flux	BD	BD FACSCanto II
Éprouvette cytomètre de flux	Faucon	# 352052
Pied à coulisse digital	Fisherbrand	14-648-17
Hémoccult TIC	Beckman Coulter	G0328QW