Nous avons développé une nouvelle approche chirurgicale pour l'administration intratrachéale d'agents bioactifs dans le fœtus de souris. L'itinéraire de livraison est plus efficace en ciblant les poumons de foetus de souris que l'couramment utilisés injection intra-amniotique. Cette procédure n'a jusqu'à présent pas été décrits dans un modèle de souris.
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Article de méthode
Une nouvelle approche chirurgicale pour l'administration intratrachéale d'agents bioactifs dans un modèle de souris fœtale
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Prénatale administration pulmonaire de cellules, gènes ou des agents pharmacologiques pourrait servir de base à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une variété de maladies génétiques et acquises. En dehors des anomalies congénitales ou héréditaires avec l'exigence d'expression à long terme du gène livré, plusieurs organisations non héritées des affections périnatales, où l'expression des gènes à court terme ou une intervention pharmacologique est suffisante pour obtenir des effets thérapeutiques, sont considérées comme des indications potentielles futures de cette type d'approche. Maladies candidates à l'application de la thérapie à court terme prénatal pourrait être la carence néonatale transitoire de la protéine B tensioactif provoque néonatale 1,2 respiratoire syndrome de détresse ou de blessures hyperoxiques du poumon néonatal 3. Maladies candidates pour la correction permanente thérapeutique sont la fibrose kystique (FK) 4, les variantes génétiques de 5 tensioactifs carences et α1-antitrypsine 6. <p class = "jove_content"> En règle générale, un avantage important de la thérapie génique prénatale est la capacité à amorcer une intervention thérapeutique précoce dans le développement, au niveau ou même avant les manifestations cliniques chez le patient, évitant ainsi des dommages irréparables à l'individu. En outre, les organes du fœtus ont un taux de prolifération cellulaire accrue par rapport aux organes adultes, ce qui pourrait permettre à un gène ou d'un transfert plus efficace de cellules souches dans le foetus. En outre, la délivrance de gènes in utero est effectuée lorsque le système immunitaire de l'individu n'est pas complètement mature. Par conséquent, la transplantation de cellules hétérologues ou la supplémentation d'une protéine non fonctionnelle ou absente avec une version correct ne devrait pas entraîner une sensibilisation à l'abri de la cellule, vecteur ou un produit transgénique, qui a récemment été prouvé être le cas avec les thérapies cellulaires et génétiques 7 .
Dans la présente étude, nous avons étudié la possibilité de cibler directement la trachée fœtale dans un m de la sourisodèle. Cette procédure est en cours d'utilisation dans des modèles animaux plus grands comme les lapins et les moutons 8, et même dans un contexte clinique 9, mais n'a jusqu'à présent pas été effectuée avant dans un modèle murin. Lorsque l'on étudie le potentiel de la thérapie génique pour les maladies génétiques du fœtus tels que CF, le modèle de souris est très utile en tant que première preuve de concept en raison de la grande disponibilité des différentes souches de souris transgéniques, l'embryogenèse bien documenté et le développement du fœtus, moins strictes règles d'éthique, de gestation courte et la taille de la portée large.
Voies d'accès différentes ont été décrites pour cibler les poumons des rongeurs fœtale, y compris injection intra-amniotique 10-12, (écho-guidée) intrapulmonaire d'injection et 13,14 administration intraveineuse dans les vaisseaux du sac vitellin 15,16 ou 17 veine ombilicale. Notre nouvelle procédure chirurgicale permet aux chercheurs d'injecter l'agent de choix directement dans la trachée de souris foetale qui permetpour une livraison plus efficace pour les voies respiratoires que les techniques existantes 18.
Protocole
1. L'accouplement des souris pour obtenir stade de la grossesse désirée
Temps maté enceintes souris NMRI afin qu'ils soient 18 jours (E18) enceintes (grossesse totale E19.5) au moment de la chirurgie. Avant et après la chirurgie, ils sont logés dans des cages de filtre haut à température ambiante normale et la lumière du jour avec un accès libre à l'eau et la bouffe.
2. Fœtale par voie intratrachéale (IT) Injection (Figure 1)
- D'abord soumettre la souris NMRI enceinte à l'anesthésie générale avec 1,5% d'isoflurane dans un mélange de O 2 à 1,5 L / min. Le niveau de l'isoflurane dépend de l'âge et de la souche de la souris, mais en général, l'isoflurane doit être à un niveau qui met les animaux dans l'état d'anesthésie. Ensuite, placez la souris enceintes sur un coussin chauffant (37 ° C) pour maintenir la température du corps pendant chirurgie.
- L'ensemble de la procédure chirurgicale est réalisée par deux chirurgiens. Un chirurgien va effectuer la dissection de la souris enceintes et l'exposition subséquente des efoetus e pour injection intratrachéale. Le deuxième chirurgien va effectuer l'injection intra-trachéale fœtale elle-même. L'intervention chirurgicale est réalisée à l'aide d'instruments stériles et d'une technique aseptique.
- Désinfecter l'abdomen avec de l'iodure de povidone et réaliser une laparotomie médiane pour exposer l'utérus gravide. Extérioriser une des cornes utérines à la fois et compter le nombre de sacs gestationnels. Un foetus par corne est opéré et choisis en fonction de la position optimale pour l'extériorisation de la tête fœtale dans les étapes ultérieures. Le foetus plus approprié est choisi par visualisation à travers la paroi utérine. Le nez de la tête fœtale doit pointer vers le chirurgien qui fera une injection dans la trachée après exposition de la tête fœtale et le fixer à l'envers (comme expliqué à l'étape ultérieure 2,5).
- D'abord passer un 6-0 en polypropylène (Prolene) suture en bourse d'environ 1 cm de diamètre à travers la paroi utérine et les membranes fœtales (amniotique membrane et pariétale du sac vitellin) sur la zone où le côté de la tête du foetus est exposé à travers. Cette suture maintient le fœtus fixée à l'intérieur de l'utérus à partir du épaules. Ensuite, faire une incision dans l'utérus à l'intérieur de la chaîne de sac à main d'environ 0,8 cm à l'aide des ciseaux bien aiguisés.
- Appuyez doucement sur la tête et le cou du fœtus à travers le hystérotomie. Tirez sur la suture en bourse doucement serré autour du cou et le fixer en position avec 2 micro-moustiques forceps. La tête fœtale est maintenu en hyperextension par un 5-0 polyglactine 910 (Vicryl) de suture sur deux pinces placées dans la bouche autour de la mâchoire supérieure.
- En microscopie stéréoscopique zoom (grossissement x10) la trachée fœtale est visualisée par une incision verticale à l'aide du cou dissection fine et émoussé. L'incision dans la région du cou est d'environ 5 mm de long. Il s'agit d'une incision superficielle, comme le tissu sous-jacent est encore disséquée par dissection pour atteindre la trachée.
- Dans la vision directe à travers le microscope stéréoscopique zoom, injecter un volume total de 30 ul de la substance (par exemple, des billes fluorescentes ou vecteur viral) dans la trachée à l'aide d'une seringue de 50 ul verre Hamilton avec une aiguille 30 G pointu. Après le retrait de l'aiguille, efflux minimal du liquide injecté assure une injection correcte. L'incision n'est pas fermée après l'injection.
- Pour remplacer la tête dans l'utérus, appliquer une légère pression sur le nez. Le cou va d'abord revenir dans l'utérus, suivi par la tête. Le nez va en dernier. Ensuite, fermez l'hystérotomie en serrant la chaîne de sac à main. Puis injecter un total d'environ 0,5 ml de solution physiologique dans la cavité amniotique pour éviter oligohydramnios. Pour ce faire, insérer une aiguille dans l'incision à l'intérieur de la chaîne de sac à main. Ensuite, tout près de la suture autour de l'aiguille, après quoi on injecte une solution saline. Dans une dernière étape, rétracter l'aiguille, suivie par la fermeture complète de la pUrse chaîne.
- Fermez la paroi abdominale maternelle (péritoine et la couche musculaire interne et externe) et de la peau avec un 5-0 surjet de Vicryl en deux couches séparées. Par la suite, infiltrer l'incision avec la xylocaïne 0,2% pour le soulagement de la douleur post-opératoire. Il est recommandé d'utiliser la buprénorphine (0,05 - 0,1 mg / kg SC ou IP) pour le soulagement de la douleur post-opératoire. Ni les tocolytiques prophylactiques, ni antibiotiques sont utilisés. Les souris sont conservés sur un coussin chauffant (37 ° C) jusqu'à ce qu'ils soient complètement rétablis (environ 1 heure).
3. Fœtale intra-amniotique (IA) Injection
- Voir 2.1
- Désinfecter l'abdomen avec de l'iodure de povidone et réaliser une laparotomie médiane pour exposer l'utérus gravide. Extérioriser une des cornes utérines à la fois et compter le nombre de sacs gestationnels.
- Injection IA peut être effectuée sur tous les fœtus car il prend moins de temps à effectuer. En outre, la position du fœtus n'est pas critiquecal par rapport à l'injection intra-trachéale. Comme la paroi utérine est semi-transparent, les structures fœtales telles que la tête, les membres et la position de la queue et du placenta sont bien visibles.
- En utilisant la même aiguille et seringue comme ci-dessus (2,7), injecter 30 ul de substance dans le voisinage de l'embouchure du foetus. Cela peut se faire plus facilement que ce soit entre la tête fœtale et des membres antérieurs, ou entre les membres inférieurs et la queue. L'injection est effectuée uniquement après un examen minutieux de la position de l'aiguille de sorte que pas de structures foetales sont en contact avec l'embout au moment de l'injection.
- L'utérus est repositionné dans l'abdomen et la paroi abdominale et la peau fermée comme décrit ci-dessus (2,9).
4. Évaluation des fœtus injectés et la Croix-promotion
- Tuer la mère à l'aide d'une méthode approuvée euthanasie 36 heures après l'intervention du foetus (à E19.5). La dislocation cervicale sans plusl'anesthésie serait la meilleure méthode, comme toutes les autres formes d'euthanasie qui comprennent l'anesthésie (isoflurane, par exemple, le pentobarbital) sera anesthésier ou même tuer les fœtus, ce qui vous veulent éviter à tout moment. Livrer les fœtus fonctionnant sur-par césarienne. Les foetus opérés sont identifiés dans l'utérus de leur position. Sacs amniotiques sont numérotées à partir de la fin de l'ovaire de l'utérus bicorne.
- Après l'accouchement, les critères suivants sont utilisés pour évaluer la viabilité des fœtus: la présence de (1) un battement de coeur, (2) la couleur de peau rose (contre cyanotique) et (3) des mouvements spontanés. Placez chiots seulement répondent à ces critères dans la litière une mère adoptive qui contient une journée chiots âgés. Par expérience, nous savons que les chiots avec un battement de coeur faible, la couleur de peau cyanose et / ou quelques mouvements spontanés ne sont souvent pas survivre en raison du rejet de la litière de la mère adoptive ou par le cannibalisme de la mère.
- Après l'accouchement ofa colorant visible via l'informatique ou injection IA (par exemple, des molécules fluorescentes rouges), il est possible d'assurer une injection correcte par la présence de ce colorant (couleur rose des fluospheres injectés en rouge) dans le thorax (par injection directe dans les poumons après IT injection ou par inhalation dans les poumons après injection IA) ou de la cavité abdominale (par voie orale). Ceci est possible grâce au fait que les souriceaux nouveau-nés sont semi-transparents permettant une évaluation in vivo des poumons et de l'estomac.
- Marquer les chiots correctement injecté avec Encre de Chine sous-cutanée au-dessus de la base de la queue. Placez tous les chiots, qui remplissent les conditions mentionnées au paragraphe 4.2 de la litière de la mère adoptif.
- Pour assurer l'acceptation maximale et la survie des chiots exploité-on, ne laissent pas plus de 10 chiots au total dans la litière de la mère adoptif (deux propres chiots ses 1 jours d'âge, ainsi que les chiots croisées favorisées). Avant de placer le chiot fonctionnant surs dans la litière de la mère adoptif, les recouvrir de litière de la mère nourricière, contenant à la fois ses excréments et d'urine pour masquer les odeurs non familières.
- Placez la cage dans un environnement calme et ne pas déranger la litière pendant au moins 12 heures (une nuit).
- Le lendemain, soigneusement évaluer le taux de survie de favoriser en comptant tous les chiots, en faisant la distinction entre les chiots de la mère adoptif et les chiots fonctionnant sur-(marqués à l'encre de Chine et en moyenne plus petits que les autres chiots). Minimiser le temps de la manipulation de ces chiots pour éviter le rejet par la mère et pour éviter l'hypothermie. En général, si les chiots n'ont pas de lait dans leur estomac (ce qui est visible en raison de la nature semi-transparente de nouveau-nés), le pronostic est très mauvais pour la survie de ces animaux encore.
5. Les résultats représentatifs
Le schéma global de l'expérience est représenté dans Figure 2.
Détermination du volume optimal pour l'injection intra-trachéale
Pour déterminer le volume optimal pour l'informatique d'injection, nous avons choisi empiriquement différents volumes allant de 10, 20 à 30 pi (n = 3/volume). Pour la détection facile, nous avons choisi d'injecter des molécules fluorescentes rouges (fluospheres, Molecular Probes, Leiden, Pays-Bas) taille 100 nm. Après IT injection E18 fœtus anciens, les poumons ont été récoltés 24 h plus tard, fixés dans du paraformaldéhyde 4% pendant la nuit à 4 ° C et 6 um coupes congelées ont été faites. Filaments d'actine et de noyaux ont été colorés au Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) et Alexa Fluor 488 phalloïdine (Invitrogen, Merelbeke, Belgique) respectivement pendant 20 min à température ambiante. Les images confocales ont été faites en utilisant un Radiance Biorad 2100 Microscope confocal avec le logiciel LaserSharp2000.6 par Carl Zeiss. La fluorescence relative (ratio de fluorescence rouge au bleu fluospheres représentant et stainin nucléaireg, respectivement) a été quantifiée à l'aide en ligne du logiciel ImageJ (figure 3). Même si au moment de la chirurgie fœtale, un reflux a été détectée seulement après l'injection de 30 pi, ce qui indique un excès de fluides injectés, 30 pl a donné la plus grande quantité de signal fluorescent dans le parenchyme pulmonaire, telle que quantifiée en mesurant la fluorescence relative (analyse de la variance , les comparaisons pour chaque paire de Student t-test, * p <0,05, *** p <0,001).
L'évaluation quantitative des fluospheres dans le tissu pulmonaire et la biodistribution de l'appareil gastro-intestinal
Ensuite, nous avons voulu comparer l'efficacité du ciblage du poumon fœtus de souris après injection IA contre IT. Pour ce faire, 30 ul de fluospheres ont été livrés dans les poumons de souris fœtale après TI ou en injection IA E18 souris NMRI enceintes (n = 5 par groupe). IT injection donné lieu à une livraison significativement plus élevé de fluospheres dans les poumons du fœtus par rapport à l'IA. itinéraire (1,43 ± 0,56 et 0,05 ± 0,02 fluorescence relative (rapport de fluospheres à Hoechst, respectivement, l'analyse de la variance, t de Student-test, *** p <0,001) (figures 4 ac). fœtus témoins non traitées ont été utilisées pour la normalisation des fluorescente fond du signal. L'tractus gastro-intestinal a été positive à la fois pour l'informatique et les animaux injectés IA (Figure 4 d). Aucune fluorescence rouge a été observée dans d'autres tissus du fœtus traités ou chez les animaux témoins négatifs (données non présentées).
Comparaison de l'injection intratrachéale et intra-amniotique après rAAV2/6.2 transfert de gènes médié par le poumon fœtal
Après avoir comparé les deux méthodes de livraison en injectant des molécules fluorescentes, nous avons voulu évaluer l'efficacité de la transduction virale et l'expression des gènes suite après injection IA de l'information et l'utilisation de vecteurs rAAV. rAAV2/6.2 encodage luciférase de luciole (fluctuations) (3x10 10 GC / fœtus)sous le contrôle du poulet-β-actine (ABC) a été injecté promoteur IT (n = 8) ou IA (n = 6) chez des souris NMRI fœtales à E18. Après la césarienne et la promotion, survivant chiots ont été suivis par imagerie par bioluminescence non-invasive (BLI) et suivi de l'activité Fluc (photons / seconde, P / S) à 1 semaine d'âge (figure 5). Le flux de photons total pour le groupe informatique a été significativement plus élevé que dans le groupe IA et le contrôle négatif (analyse de variance, les comparaisons pour chaque paire de Student t-test, * p <0,05). La moyenne du signal BLI dans le groupe IA n'était pas significativement plus élevé que dans le groupe témoin négatif.
Distinction entre une bonne et une mauvaise injection intratrachéale fœtale
Distinction entre un bon et un incorrectI.T. d'injection peut être évaluée à plusieurs niveaux. À l'instant de l'opération, lors de l'injection dans la trachée du foetus, aucune résistance remarquera lorsque le needle est positionné dans la trachée. Cependant, une plus grande résistance sera remarqué lors de l'injection dans l'espace paratrachéal. Deuxièmement, lors de la césarienne que le fœtus est semi-transparent, il est possible de voir les poumons et par la suite la présence d'un colorant visible (par exemple l'encre de Chine, des molécules fluorescentes). Une dernière option afin d'évaluer une injection correcte est par imagerie optique et plus particulièrement l'imagerie par bioluminescence. BLI est un système élégant de manière non invasive l'expression du gène de suivi de la luciférase firefly gène rapporteur, mais la résolution spatiale et informations anatomiques sont limitées. Imagerie par résonance magnétique (IRM) offre une haute résolution, des images tomographiques contenant des informations détaillées sur l'anatomie. Par conséquent, nous avons étudié la combinaison de BLI avec l'IRM pour obtenir une image en surimpression, qui combine le signal BLI surface avec une visualisation des structures anatomiques profondes (organes internes). Notre objectif était d'obtenir des informations plus détaillées dans vivo de la section localetion de l'expression du gène d'être en mesure de distinguer une bonne d'une mauvaise IT injection.
Combinés BL-MR images ont été acquises sur plusieurs animaux injectés avec IT rAAV2/6.2 ABC-CBA-Fluc et LacZnls (3x10 10 GC / fœtus pour chaque vecteur, n = 10) à une semaine d'âge (figure 6). BL imagerie a révélé un signal issu du cou et de la région thoracique. Co-enregistrement de l'IRM avec BLI l'expression du gène luciférase situé dans la région pulmonaire suite à une injection correcte (Figure 6 a), mais dans le cou et l'abdomen après une injection incorrecte (figure 6 b). L'analyse histologique par coloration X-gal a confirmé in vivo co-inscription.
La survie après injection intratrachéale et intra-amniotique
- Fluorosphères
Le taux de survie à la livraison du foetus E18 NMRI vieux injecté IT ou IA avec 30 pl 100 nm rouge fluorescenmolécules t était de 100% dans les deux groupes et a été défini comme le nombre de fœtus injectés vivants au moment de la récolte, 24 heures après l'intervention chirurgicale fœtale (tableau 1). - vecteur rAAV
Le taux de survie à la livraison du foetus injecté IT ou IA avec rAAV2/6.2, qui est défini comme le nombre de fœtus vivants au point de l'injection section césarienne après 36h fœtale, était de 85,3% et 86,3%, respectivement (tableau 1). Le taux de survie néonatale précoce était de 53,3% (TI) et 74,5% (IA), respectivement, et a été calculé en corrélant le nombre de chiots vivants 1 jour après la promotion avec le nombre initial de fœtus injectés. Pour obtenir ces taux de survie final, nous avons optimisé le protocole intervention chirurgicale péri-opératoire à l'aide de (1) par inhalation d'isoflurane que l'anesthésie au lieu de l'administration d'un mélange de kétamine (75 mg / kg IP) et la médétomidine (1 mg / kg IP) , (2) un coussin chauffant pour prévenir l'hypothermie pendant la chirurgie, (3),un microscope stéréoscopique zoom et (4) les opérateurs obtenir plus d'expérience à l'intervention chirurgicale.
Figure 1. Injection intratrachéale chez les souris E18 fœtales. Dans cette figure, les principales étapes de la procédure chirurgicale pour l'injection IT fœtus sont représentés. Dans une première étape, on corne utérine est extériorisé. Dans une prochaine étape, une suture en bourse est passé à travers la paroi utérine et les membranes fœtales (membrane amniotique et pariétal du sac vitellin) sur la zone où plus tard la tête du foetus est exposé à travers. Ensuite, la tête et le cou du fœtus sont extériorisé à travers l'hystérotomie, après quoi la tête fœtale est maintenu en hyperextension par un 5-0 polyglactine 910 de suture sur deux pinces entre les mâchoires. En microscopie stéréoscopique zoom (grossissement x10) la trachée fœtale est visualisée en faisant un Incis cou verticalesions en utilisant dissection fine et émoussé. Dans une dernière étape, un volume total de 30 ul de la substance est injectée dans la trachée sous vision directe à travers le microscope stéréoscopique zoom.
Figure 2. Vue d'ensemble de l'expérience.
Figure 3. Détermination du volume optimal pour l'injection intratrachéale. Afin de déterminer le volume optimal pour l'informatique d'injection, 10, 20 ou 30 pi (n = 3/volume) de fluospheres rouges de taille 100 nm ont été administrés en E18 fœtus anciens et les poumons ont été récoltés 24 h plus tard. Filaments d'actine et de noyaux ont été colorés au Hoechst 33258 et phalloïdine Alexa Fluor 488 respectivement. La fluorescence relative (ratio de fluorescence rouge au bleu représentant fluospheres et coloration nucléaire respectivement) a été quantifiée à l'aide en ligne du logiciel ImageJ. Moyenne ± écart type, analyse de variance, les comparaisons pour chaque paire de Student t-test, * p <0,05, *** p <0,001.
Figure 4. L'évaluation quantitative des fluospheres dans le tissu pulmonaire et la biodistribution de l'appareil gastro-intestinal. 30 ul de fluospheres rouges ont été livrés dans les poumons de souris fœtale après (a) TI ou (b) injection IA de E18 souris NMRI enceintes de comparer l'efficacité du ciblage le poumon de souris fœtale. Chez les témoins non traités ont été utilisés pour la normalisation du signal de fond fluorescent. Filaments d'actine et de noyaux ont été colorés au Hoechst 33258 et phalloïdine Alexa Fluor 488, respectivement. (C) La fluorescence relative (ratio de fluorescence rouge au bleu représentant fluospheres et coloration nucléaire respectivement) a été quantifiée à l'aide en ligne du logiciel ImageJ. (d) Le tractus gastro-intestinal a été positive à la fois pour l'informatique et les animaux injectés IA. Moyenne ± écart type, analyse de la variance, t de Student-test, *** p <0,001. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 5. Comparaison de l'injection intratrachéale et intra-amniotique après rAAV2/6.2 transfert de gènes médié par le poumon fœtal. Signal de BLI moins 1 semaine après l'injection de rAAV2/6.2 (3 × 10 10 CG / foetus ABC-Fluc) avec une quantification correspondant de flux de photons totale . Tous les animaux ont été scannés, séparés par des cloisons noires, pour éviter la diffusion de photons pour animaux voisins. L'échelle de pseudo-représente le flux de photons par seconde, Par centimètre carré et par stéradian (p / s / cm 2 / sr). Les mesures ont été obtenues dans un 4,3 cm 2 zone rectangulaire d'intérêt. Moyenne ± écart type, analyse de variance, les comparaisons pour chaque paire de Student t-test, * p <0,05. Figure adaptée de Carlon et al., 2010. Reproduit avec la permission de Macmillan Publishers Ltd: [Molecular Therapy] (doi: 10.1038/mt.2010.153), le droit d'auteur (2010). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 6. Distinction entre une bonne et une mauvaise injection intratrachéale fœtus à la suite rAAV2/6.2 transfert de gènes médié par le poumon fœtal. Combiné BL-MR images ont été acquises sur plusieurs animaux injectés avec IT rAAV2/6.2 ABC-CBA-Fluc et LacZnls (3x10 10 GC / foetus pour chaque vector) à une semaine d'âge. BL imagerie a révélé un signal issu du cou et de la région thoracique. Co-enregistrement de l'IRM avec BLI l'expression du gène luciférase situé dans la région pulmonaire suite à une injection correcte (a), mais dans le cou et l'abdomen après une injection incorrecte (b). L'analyse histologique a confirmé in vivo co-inscription. Barre d'échelle = 100 um. Figure adaptée de Carlon et al., 2010. Cliquez ici pour agrandir la figure .
| Produit d'injection | Procédé d'injection | Survie à la livraison d'un | Le taux de survie de promouvoir b | Néonatale précoce taux de survie c |
| fluospheres | IT | 100 (8.8) | na | na |
| IA | 100 (5/5) | na | na | |
| rAAV2/6.2 | IT | 85,3 (64/75) | 62,5 | 53,3 (40/75) |
| IA | 86,3 (44/51) | 86,4 | 74,5 (38/51) |
Tableau 1. La survie après injection intratrachéale ET intra-amniotique FOETUS. Une survie jusqu'à la livraison, c'est à dire après la chirurgie foetale et en cas de césarienne, avant la promotion. Chiots b ont été seulement favorisé si elles étaient roses, le déplacement et respirer normalement. C Le taux de survie néonatale précoce est exprimé en fonction du nombre initial de petits injectés. Abréviations: IT injection intratrachéale; IA injection intra-amniotique; na pas applicable.
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Discussion
Les étapes critiques
- La souche de souris, nous avons choisi de travailler avec des souris NMRI est parce qu'ils ont un nombre abondant de chiots (portée moyenne 14,4 ± 1,8, propres données), de tolérer des interventions bien et ont de bonnes caractéristiques maternelles.
- Placer le cordon de bourse à travers la paroi de l'utérus et les membranes fœtales est une étape critique que vous ne souhaitez pas exposer la tête du foetus et non les épaules, sinon repositionnement est presque impossible s...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
MC et AVDP doctorants sont pris en charge par des subventions de l'Institut pour la promotion de l'innovation par la science et la technologie en Flandre (IWT-Vlaanderen). JT est titulaire d'une bourse à temps partiel de recherche clinique (KOOR) de l'UZ Leuven. DV est un doctorant financé par une subvention de la KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC est un doctorant financé par une subvention du Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) et Erasmus Mundus. La recherche a été financée par l'IWT-Vlaanderen, par le DIMI subvention de la CE (LSHB-CT-2005-512146) et par l'imagerie moléculaire in vivo groupe de recherche (IMIR) de la KU Leuven. Nous tenons à remercier le Core Vecteur UPenn fondée par James M. Wilson pour leur aimable don de l'emballage AAV6.2 plasmide pour la production de vecteurs rAAV.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| Souris NMRI | Janvier, Le Genest St Isle, France | ||
| L'isoflurane | Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, Royaume-Uni | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgique | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgique | ||
| 50 pl Hamilton Seringue en verre, Modèle 1710.5 TLLX SYR | Hamilton, Reno, NV, États-Unis | 5495-20 | |
| Aiguille 30G forte | Hamilton, Reno, NV, États-Unis | 7762-03 | |
| Xylocaïne 2% | AstraZeneca, Zoetermeer, Pays-Bas |
Références
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