La culture des explants neuraux de disséqué Xenopus laevis Embryons qui expriment des protéines de fusion fluorescentes pour l'imagerie permet de dynamique de croissance du cytosquelette cône.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Le processus complexe de guidage axonal est largement déterminée par le cône de croissance, qui est la structure dynamique mobiles à la pointe de l'axone en croissance. Au cours de la croissance axonale, le cône de croissance doit intégrer plusieurs sources d'information signal de guidage de moduler son cytosquelette afin de propulser le cône de croissance avant et naviguer avec précision pour trouver ses objectifs spécifiques 1. Comment cette intégration se fait au niveau du cytosquelette est encore émergent, et l'examen de protéine du cytosquelette et de la dynamique effectrices dans le cône de croissance peut permettre à l'élucidation de ces mécanismes. Cônes de Xenopus laevis de croissance sont assez grande (10-30 microns de diamètre) pour effectuer de résolution imagerie en temps réel de la dynamique du cytosquelette (par exemple 2-4) et sont faciles à isoler et manipuler dans un laboratoire par rapport à d'autres vertébrés. La grenouille est un système modèle classique pour les études de la neurobiologie du développement, et d'importantes réflexions précoces en micro cône de croissancedynamique rotubule ont d'abord été trouvés en utilisant ce système 5-7. Dans cette méthode 8, les œufs sont recueillis et fécondés in vitro, injection de l'ARN codant pour des protéines de fusion marquées par fluorescence du cytosquelette ou d'autres constructions pour manipuler l'expression des gènes, puis on le laisse se développer jusqu'au stade du tube neural. Tube neural sont isolées par la dissection, puis sont cultivées, et les cônes de croissance des neurites sur l'étroit sont imagés. Dans cet article, nous décrivons comment effectuer cette méthode, dont le but est de culture cônes de Xenopus laevis de croissance pour l'analyse d'images à haute résolution ultérieure. Bien que nous apportions l'exemple de la protéine de fusion + TIP EB1-GFP, cette méthode peut être appliquée à n'importe quel nombre de protéines d'élucider leurs comportements dans le cône de croissance.
Protocole
Remarque: Nous décrivons les étapes décrites dans les deux premières sections seulement en bref, que des protocoles d'excellentes avec des informations détaillées ont été publiées ailleurs qui se concentrent plus spécifiquement sur ces mesures (par exemple 8-12). En outre, le protocole général de travailler avec les neurones spinaux Xenopus dans la culture de cellules vivantes a déjà été publié dans un article détaillé méthodes 8. Nous recommandons vivement revoir cet article comme un complément à cette vidéo, même si ici on ne fournir suffisamment d'informations pour effectuer avec succès et dépanner la dissection du....
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Discussion
Xenopus laevis explants neuraux envoyer des neurites de façon très robuste de 24 heures après placage sur la laminine / poly-lysine substrat si les conditions s'y prêtent. Avec ce substrat, des cônes de croissance sont très mobiles et peuvent atteindre des longueurs de l'axone jusqu'à 1 mm, s'étendant dans toutes les directions vers l'extérieur à partir de l'explant, bien longueurs typiques sont 100 um ou plus. Si neurites ne se développent pas, il ya un nombre limité de raisons pour que.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier Bob Freeman pour la formation et le laboratoire de Kirschner pour l'utilisation de la facilité de grenouille, et des membres du laboratoire Vactor Van de soutien. Nous remercions le Nikon Imaging Center à Harvard Medical School de l'aide pour la microscopie optique pour les images de la figure 1. Ce travail a été financé par le texte suivant: NRSA NIH bourse et les NIH K99 bourse à LAL, Basic Science Partnership financement ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) à l'AEF, et les NIH RO1 NS035909 de DVV
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| La gonadotrophine chorionique | Argent Laboratoires Chimique | C-HCG-ON-10 | |
| Cystéine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillaire Aiguilles Borosil 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma | F2637 | |
| Dumont # 5 Biologie Inox Pince | Outils Fine Science | 11252-20 | |
| Collagénase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Plats Mattek | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| La poly-L-Lysine | Sigma | P-1399 | |
| La laminine | Sigma | L2020 | |
| TS3 | Sigma | N1905 | |
| BDNF | Sigma | B3795 |
Références
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosc....
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Réimpressions et autorisations
