La culture des explants neuraux de disséqué Xenopus laevis Embryons qui expriment des protéines de fusion fluorescentes pour l'imagerie permet de dynamique de croissance du cytosquelette cône.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le processus complexe de guidage axonal est largement déterminée par le cône de croissance, qui est la structure dynamique mobiles à la pointe de l'axone en croissance. Au cours de la croissance axonale, le cône de croissance doit intégrer plusieurs sources d'information signal de guidage de moduler son cytosquelette afin de propulser le cône de croissance avant et naviguer avec précision pour trouver ses objectifs spécifiques 1. Comment cette intégration se fait au niveau du cytosquelette est encore émergent, et l'examen de protéine du cytosquelette et de la dynamique effectrices dans le cône de croissance peut permettre à l'élucidation de ces mécanismes. Cônes de Xenopus laevis de croissance sont assez grande (10-30 microns de diamètre) pour effectuer de résolution imagerie en temps réel de la dynamique du cytosquelette (par exemple 2-4) et sont faciles à isoler et manipuler dans un laboratoire par rapport à d'autres vertébrés. La grenouille est un système modèle classique pour les études de la neurobiologie du développement, et d'importantes réflexions précoces en micro cône de croissancedynamique rotubule ont d'abord été trouvés en utilisant ce système 5-7. Dans cette méthode 8, les œufs sont recueillis et fécondés in vitro, injection de l'ARN codant pour des protéines de fusion marquées par fluorescence du cytosquelette ou d'autres constructions pour manipuler l'expression des gènes, puis on le laisse se développer jusqu'au stade du tube neural. Tube neural sont isolées par la dissection, puis sont cultivées, et les cônes de croissance des neurites sur l'étroit sont imagés. Dans cet article, nous décrivons comment effectuer cette méthode, dont le but est de culture cônes de Xenopus laevis de croissance pour l'analyse d'images à haute résolution ultérieure. Bien que nous apportions l'exemple de la protéine de fusion + TIP EB1-GFP, cette méthode peut être appliquée à n'importe quel nombre de protéines d'élucider leurs comportements dans le cône de croissance.
Protocole
Remarque: Nous décrivons les étapes décrites dans les deux premières sections seulement en bref, que des protocoles d'excellentes avec des informations détaillées ont été publiées ailleurs qui se concentrent plus spécifiquement sur ces mesures (par exemple 8-12). En outre, le protocole général de travailler avec les neurones spinaux Xenopus dans la culture de cellules vivantes a déjà été publié dans un article détaillé méthodes 8. Nous recommandons vivement revoir cet article comme un complément à cette vidéo, même si ici on ne fournir suffisamment d'informations pour effectuer avec succès et dépanner la dissection du tube neural et le protocole de placage à l'étape 3.
1. Fécondation In Vitro œufs de Xenopus
- Obtenir des œufs de grenouilles femelles qui ont été injectés avec la gonadotrophine chorionique (400 unités / grenouille) 12-18 heures avant la collecte des œufs. Ramassez les œufs dans une solution 1X Marc Ringer modifiée (MMR) (0,1 M de NaCl, 2,0 mM KCl, 1,0 mM MgSO 4, 2,0 mM de CaCl 2, 5,0 mM d'HEPES, pH 7,4) 9.
- Féconder les oeufs in vitro avec des testicules hachés, comme décrit précédemment 9.
- Après au moins 20 minutes, retirez embryon gelée manteau en incubant embryons en cystéine 2% ROR 1X (ajustée à pH 7,8 avec NaOH) pendant 3-5 min. Laver avec 0,1 X MMR (ou 0,1 x MBS (modification Saline Barth, recette 1X: 88 mM NaCl, 1 mM de KCl, 0,7 mM de CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 2,5 mM NaHCO 3, 5 mM d'HEPES, pH 7,8)) 3 embryons à 5 fois, et garder à température ambiante jusqu'à ce que les injections, ou le cas échéant, les embryons lieu à 14-18 ° C pour ralentir le développement.
2. La micro-injection de l'ARN
Remarque: si nous utilisons l'injection d'ARN ici, ces techniques ne sont pas limités à l'ARN et de l'ADN, des protéines ou des acides nucléiques modifiés pour la manipulation génétique peuvent également être utilisés et ont été décrits précédemment 12.
- Avant d'expérimentation, ARN pour l'étiquetage des structures du cytosquelette ou d'autres are transcrit à partir de matrices d'ADN linéarisées en utilisant le kit mMessage mMachine (Ambion). ARNm nécessitent une coiffe en 5 'et en 3' de queue de polyadénylation, de promouvoir la traduction et prévenir la dégradation de l'embryon. pCS2 + est un vecteur couramment utilisé à cette fin, et le kit de transcription comprend un analogue de cap au cours de la réaction de synthèse. Nous remettre en suspension dans l'ARNm transcrit sans nucléase ddH 2 0, à une concentration stock entre 500 et 2.000 ng / ul, suivie d'un stockage rapide à -80 ° C. Avant l'injection, diluer l'ARN dans ddH 2 0 à la concentration appropriée pour l'injection. Étant donné que seul un petit volume seront injectées dans des embryons, la remise en suspension dans du tampon n'est pas nécessaire. Notre concentration d'injection final est généralement de 50 à 200 pg / nl, en fonction de la construction, et nous avons l'habitude va injecter jusqu'à 4 nl par embryon, bien que de nombreux laboratoires traditionnellement injecter jusqu'à 10 nl, ce qui représente environ 1% du volume total des un embryon. ARN peut être toxique à fortes doses, et la dose par genres embryonlly varie de 10 pg à 1 ng, bien que jusqu'à 5 ng peut être toléré en fonction de la gène particulier et de la pureté. Cependant, pour la localisation des protéines d'imagerie, le niveau le plus bas possible devrait être injecté pour éviter la sur-expression des artefacts. ARN pour EB1-GFP dans ce protocole est utilisé au montant final de 250 pg par embryon.
- Préparer aiguilles d'injection capillaire en tirant avec une aiguille de traction 9, à un diamètre de pointe de ~ 0,2 um. Avec une Sutter P-87 extracteur, nous utilisons les paramètres suivants: chaleur 644, traction 125, vitesse 70, temps de 250, mais ces paramètres diffèrent en fonction de la machine et doit être réajusté après avoir changé le filament (nous utilisons actuellement de 2,5 mm filament carré qui est de 2,5 mm de large). Sous un microscope, briser pointe de l'aiguille avec une pince à un angle de générer une forme plume-like. Il existe d'autres méthodes pour briser et le remplissage des aiguilles d'injection (par exemple 11,12), mais nous remplissons l'aiguille avec de l'ARN en plaçant une petite goutte (0,5 - 1 pl) à l'extrémité arrière de laaiguille. Pour micro-injection dans des embryons, il ya un certain nombre de systèmes d'injection disponibles dans le commerce, deux des plus courantes étant le Pico-injecteur (Medical Systems), et le Nanoject (Drummond Scientific) (voir 11 pour plus d'informations). Nous utilisons le Medical Systems PLI-100 Pico-injecteur, qui utilise du gaz comprimé pendant une période de temps définie numériquement afin de livrer des volumes nanolitre cohérentes. Volume d'injection doit être calibré pour chaque micropipette nouveau en utilisant un micromètre, et le temps d'injection doit être ajustée pour obtenir la quantité désirée de l'ARN injecté.
- Lieu fécondé embryons au 1 - à 4-cell étape dans un plat en plastique contenant 5% de Ficoll à 0,1 X MMR. Maintien en place de l'embryon avec des pinces, ou placer dans une plate-forme de support (une maille plastique, avec une grille de ~ 1 mm, collée au fond du récipient avec la pâte à modeler ou de la cire dentaire), injecter dans le volume désiré blastomères animaux (voir l'étape 2,1 Pour plus de détails concernant les volumes d'injection). Distribuer dans plusieurs loctions tout au long de l'embryon, au moins une injection dans chacun des blastomères animaux, pour obtenir une répartition plus uniforme (par exemple, pour un embryon au stade de 4 cellules, nous avons généralement injecter 1-2 fois dans chaque blastomère, alors que dans un stade 2-cellules embryon, on injecte 2-4 fois dans chaque blastomère). Un autre avantage de l'attente jusqu'à ce que le stade 2-4 cellules est de vous assurer que l'embryon a commencé à s'attacher normalement. Toutefois, si le temps est de l'essence, vous pouvez commencer à l'étape 1-cellule, avec peu de différence dans le résultat final autre que plus d'embryons devant être injectée. Embryons à un stade plus âgés peuvent aussi être utilisés, ce qui est particulièrement utile si des types cellulaires spécifiques sont ciblés pour l'injection, mais que nous préférons généralement une expression plus large, nous injectons dans les jeunes embryons de réduire le besoin d'injections plus nombreux.
- Transfert embryons injectés dans un plat en plastique contenant 0,1 X MMR et leur permettre de développer jusqu'au stade 20-23 13. Incuber les embryons de 14 à 22 ° C en fonction spé désiréeed de développement. (Pour disséquer tube neural, le lendemain, utilisez ~ 22 ° C. Pour le lendemain, utilisez ~ 14 ° C)
3. Dissection du tube neural et placage
- Avant d'effectuer les dissections, préparer les 14 boîtes de culture. Tout d'abord, des lamelles manteau avec assez de solution de 200 pg / ml de poly-lysine dans du PBS à la piscine sur la surface de la lamelle, soit Mattek ou des boîtes de culture Lab-Tek, et incuber pendant une heure (en variante, on peut utiliser des lamelles de verre assis en vrac dans une boîte de Pétri, pour un placement plus tard sur lames de verre pour l'imagerie et l'immunocytochimie). Aspirer et laver avec un excès de PBS 3 fois, et laisser sécher. Puis plats manteau avec 10 ug / ml de laminine dans du PBS (nous utilisons habituellement 500 ul par lamelle, il suffit de piscine sur toute la surface) pendant une heure à 37 degrés. Aspirer la solution de laminine et laver 3 fois avec un excès de PBS, en faisant attention de ne pas laisser les surfaces revêtues de laminine être exposés à l'interface air. Remplae PBS avec des milieux de culture (50% de Ringer, 49% de L-15 médias, 1% de sérum fœtal bovin, plus 50 pg / ml de pénicilline / streptomycine et la gentamicine, à pH 7,4 et stérilisé par filtration). (Media Ringer, 115 mM NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 10 mM HEPES pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Bien que notre protocole utilise ce média, il convient de noter qu'il s'agit d'un milieu enrichi commun pour les cultures de Xenopus plus ganglionnaires de la rétine, où les neurones ont réduit l'énergie réservée. Jeunes cultures de la moelle épinière va survivre et croître pendant plus de 24 heures dans les médias Sonneries pures, sans autres facteurs de croissance, et c'est bien là l'un des avantages de l'utilisation de ce système. Facultatif: Ajouter NT3 et le BDNF (pour des concentrations finales de 25 ng / ul chacun) pour les milieux de culture pour augmenter la croissance axonale.
- En raison de la variabilité de l'expression de l'ARNm injecté, les embryons peuvent présenter une mosaïque de fluorescence. Avant d'effectuer les dissections, les embryons d'écran pour la présence de fluorescence, à identifier les embryons qui expRESS la protéine de fusion fluorescente dans le tube neural. Placer les embryons au stade 20-23 fluorescentes dans un plat d'agarose à revêtement en matière plastique rempli de médias Steinberg (58 mM de NaCl, 0,67 mM de KCl, 0,44 mM de Ca (NO 3) 2, 1,3 mM de MgSO 4, 4,6 mM de Tris, pH 7,8, puis à autoclave) 5. Pour rendre le plat d'agarose-enduit, fond plat couche de plastique fondu avec 1% d'agarose dans 0,1 X MMR et laisser durcir. Cela donne une surface douce de façon que les dommages ne se produit pas aux pinces fines et les aiguilles de tungstène utilisé lors des étapes ultérieures de dissection. Dissection d'embryons au-delà de l'étape 23 est possible, mais il est plus difficile que les tissus se conformer plus étroitement les uns aux autres et nécessitent donc un traitement plus long avec de la collagénase.
- Sous un microscope à dissection, retirez la membrane vitelline avec une pince fine, puis d'isoler toute la partie dorsale de l'embryon, en faisant une série d'incisions. Alors une pince maintenir l'embryon en place, utilisez le second pour faire une incision sur lecôté de l'embryon pour exposer l'intérieur creux. Ensuite, utiliser une pince pour pincer les deux le long du tissu entre les moitiés dorsale et ventrale de l'embryon, ce qui réduit de moitié l'embryon pour isoler la partie dorsale contenant le tube neural.
- Placez l'explant dorsale dans un tube Eppendorf de 2 mg / ml de collagénase dans les médias Steinberg pendant 15-20 min sur un agitateur, d'assouplir les tissus, puis pipette explant dorsale en plastique agarose à revêtement plat avec une solution fraîche de Steinberg. Alternativement, l'explant peut être placé dans une boîte de Pétri contenant la solution de collagénase pendant 15 min, où la dissection entière pourrait alors être effectuée.
- En utilisant une paire de pinces, doucement disséquer le tube neural de l'épiderme dorsal et ventral de la notocorde. Glisser la pointe de la pince entre l'épiderme et des tissus sous-jacents et tirant lentement l'épiderme, révélant le tube neural dessous. Ensuite, utilisez une pince pour tenir le tissu et un autre pour faire glisser la pointe entre letube neural et notocorde. Enfin, utilisez une pince pour retirer les somites de chaque côté du tube.
- Transfert du tube neural dans un plat recouvert d'agarose-rempli de milieux de culture, tel que décrit à l'étape 3.1.
- Après la collecte de plusieurs tubes neuraux, les couper en morceaux nombreuses (environ 20, si l'ensemble du tube est isolé) en utilisant des aiguilles de tungstène affûtées ou des pinces, puis les morceaux de plaques dans des boîtes de culture remplis de milieu (préparé à l'étape 3.1), l'étalement les explants uniformément en rangées.
- Après étalement, ne déplacez pas les plats parce que cela perturbe les cellules de fixation. Incuber les explants plaqués du tube neural autour de 20-22 ° C. En général, nous laisser le plat de cellules sur le banc à la température ambiante pendant une nuit. L'un des avantages de Xenopus laevis neurones, c'est que un incubateur spécial pour la culture cellulaire qui régule les niveaux de CO2 ou la température n'est pas nécessaire. Neurites et des cônes de croissance peut être observé et imagé à 12 température ambiante-24 H après étalement, bien que l'excroissance peut être accélérée par l'ajout de facteurs de croissance. En général, l'expression d'un ARN ou un produit plasmide se traduira par une expression variable entre les cellules, et donc il peut y avoir une gamme de niveaux d'expression de fluorescence entre les cônes de croissance. Nous avons observé l'expression d'ARN de protéines fluorescentes de persister au-delà de 48 heures après l'étalement, même si cela dépend de la construction particulière.
4. Les résultats représentatifs
Après avoir suivi le protocole, qui est résumée dans la figure 1A, en bonne santé, bien-disséqués et mis en culture des explants neuraux enverra axones de nombreux neurites ou dans tous les sens sur la laminine / poly-lysine substrat, illustré à la figure 1B. Les cônes de croissance à l'extrémité des axones peuvent être visualisés soit par l'optique DIC, comme on le voit dans la figure 1C, à la dynamique d'image dans l'ensemble, la motilité ou haute résolution microscopie à fluorescence pour examiner la localization de fluorescence marqués protéines du cytosquelette, par exemple, EB1-GFP est représenté sur la figure 1D.
Figure 1. Résumé du protocole expérimental et les résultats attendus. A) Protocole organigramme. Voir la vidéo pour plus de détails concernant la dissection au jour 3. Le tube neural ensemble doivent être coupés en morceaux d'environ 20 de taille égale et étaler uniformément en rangées sur la lamelle. Dans ce dessin, ciseaux sont présentés pour représenter couper le tissu avec des pinces fines. CG gonadotrophine chorionique B) image DIC ou des axones en croissance de neurites explant (explant dans le coin en haut à gauche). C) l'image de grossissement supérieur du cône de croissance à l'extrémité d'un axone en croissance. D) Image en microscopie de fluorescence de la GFP dans EB1-cône de croissance. Barre d'échelle 10 pm. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Xenopus laevis explants neuraux envoyer des neurites de façon très robuste de 24 heures après placage sur la laminine / poly-lysine substrat si les conditions s'y prêtent. Avec ce substrat, des cônes de croissance sont très mobiles et peuvent atteindre des longueurs de l'axone jusqu'à 1 mm, s'étendant dans toutes les directions vers l'extérieur à partir de l'explant, bien longueurs typiques sont 100 um ou plus. Si neurites ne se développent pas, il ya un nombre limité de raisons pour que...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier Bob Freeman pour la formation et le laboratoire de Kirschner pour l'utilisation de la facilité de grenouille, et des membres du laboratoire Vactor Van de soutien. Nous remercions le Nikon Imaging Center à Harvard Medical School de l'aide pour la microscopie optique pour les images de la figure 1. Ce travail a été financé par le texte suivant: NRSA NIH bourse et les NIH K99 bourse à LAL, Basic Science Partnership financement ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) à l'AEF, et les NIH RO1 NS035909 de DVV
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| La gonadotrophine chorionique | Argent Laboratoires Chimique | C-HCG-ON-10 | |
| Cystéine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillaire Aiguilles Borosil 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma | F2637 | |
| Dumont # 5 Biologie Inox Pince | Outils Fine Science | 11252-20 | |
| Collagénase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Plats Mattek | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| La poly-L-Lysine | Sigma | P-1399 | |
| La laminine | Sigma | L2020 | |
| TS3 | Sigma | N1905 | |
| BDNF | Sigma | B3795 |
Références
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890(2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
