Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

Résumé

Nous avons développé une plate-forme logicielle qui utilise Imaris Neuroscience, ImarisXT et MATLAB pour mesurer les changements dans la morphologie d'une forme indéfinie pris trois dimensions fluorescence confocale de cellules individuelles. Cette nouvelle approche peut être utilisée pour quantifier les changements dans la forme des cellules qui suivent l'activation du récepteur et représente donc un outil possible supplémentaire pour la découverte de médicaments.

Résumé

Les outils les plus courants de logiciels d'analyse disponibles pour mesurer images de fluorescence sont des données en deux dimensions (2D) qui s'appuient sur des réglages manuels pour l'inclusion et l'exclusion des points de données, et la reconnaissance des formes assistée par ordinateur pour appuyer l'interprétation et les conclusions de l'analyse. Il est devenu de plus en plus important de pouvoir mesurer images de fluorescence construits à partir d'ensembles de données tridimensionnelles (3D) afin d'être en mesure de saisir la complexité de la dynamique cellulaire et comprendre les bases de la plasticité cellulaire dans les systèmes biologiques. Instruments de microscopie sophistiquées ont permis la visualisation des images 3D de fluorescence grâce à l'acquisition d'images multispectrales de fluorescence et puissant logiciel d'analyse qui reconstitue les images des cheminées à foyer commun qui fournissent ensuite une représentation en 3D des images collectées en 2D. Méthodes avancées de conception basée sur stéréologie ont progressé de l'approximation et hypothèses de l'original à base de modèle stéréologie ^1, même dans des coupes tissulaires complexes ^2. En dépit de ces avancées scientifiques en microscopie, il reste un besoin pour une méthode automatisée d'analyse qui exploite pleinement les données intrinsèques 3D pour permettre l'analyse et la quantification des changements complexes de la morphologie cellulaire, la localisation des protéines et le trafic des récepteurs.

Les techniques actuelles pour quantifier les images de fluorescence sont méta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) et Image J (NIH), qui fournissent une analyse manuelle. Imaris (Andor Technology, Belfast, Irlande du Nord) logiciel fournit la fonctionnalité, MeasurementPro qui permet la création manuelle de points de mesure qui peuvent être placés dans une image de volume ou tiré sur une série de coupes 2D pour créer un objet 3D. Cette méthode est utile pour des mesures ponctuelles seul clic pour mesurer une distance en ligne entre deux objets ou pour créer un polygone qui entoure une région d'intérêt, mais il est difficile d'appliquer à complex structures du réseau cellulaire. Tracer filament (Andor) permet la détection automatique de la 3D neuronale de type filament cependant, ce module a été développé pour mesurer les structures définies comme les neurones, qui sont constitués de dendrites, axones et des épines (structure arborescente). Ce module a été ingénieusement utilisé pour effectuer des mesures morphologiques de cellules non-neuronales ^3, cependant, les données de sortie de fournir des informations d'un réseau étendu cellulaire en utilisant un logiciel qui dépend d'une forme de la cellule définie plutôt que d'être un modèle en forme amorphe cellulaire. Pour surmonter le problème de l'analyse de cellules en forme amorphe et de rendre le logiciel plus adapté à une application biologique, Imaris développé cellulaire Imaris. Il s'agissait d'un projet scientifique avec l'Eidgenössische Technische Hochschule, qui a été développé pour calculer la relation entre les cellules et organites. Bien que le logiciel permet la détection des contraintes biologiques, en forçant un noyau par celluleet l'utilisation de membranes cellulaires pour les cellules du segment, il ne peut pas être utilisé pour analyser les données de fluorescence qui ne sont pas continu, car, idéalement, il construit la surface des cellules sans les espaces vides. À notre connaissance, à l'heure actuelle aucune approche modifiable par l'utilisateur automatisé qui fournit des informations morphométriques à partir d'images de fluorescence 3D a été développé qui permet d'obtenir des informations spatiales cellulaire d'une forme non définie (Figure 1).

Nous avons développé une plate-forme d'analyse en utilisant le module de base Imaris logiciels et Imaris XT interfacé à MATLAB (Mat Works, Inc.) Ces outils permettent la mesure 3D de cellules sans une forme prédéfinie et avec incohérentes composants du réseau de fluorescence. En outre, cette méthode permettra aux chercheurs qui ont étendu l'expertise dans les systèmes biologiques, mais pas la connaissance des applications informatiques, d'effectuer la quantification des changements morphologiques dans la dynamique cellulaire.

Protocole

1. Tridimensionnelle analyse morphométrique de la cellule unique modifications phénotypiques

1. Embryonnaires humaines de rein (HEK293), les cellules ont été transfectées avec l'hémagglutinine (HA)-étiqueté corticotropin libérant du récepteur du facteur-2 (CRF-R2), un G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) comme décrit précédemment ^{4, 5.}
2. Les cellules ont été laissées sans traitement (pas de traitement, NT), stimulées avec le ligand endogène CRF-R2, facteur de libération de corticotropine, CRF (1 uM, 30 min), ou prétraité avec un sélectif CRF-R2 antagoniste, anti-sauvagine 30 (AS -30, 1 pM, 30 min) avant le traitement agoniste.

Discussion

Nous avons montré que le traitement CRF induit un changement important dans la morphologie et la localisation de CRF-R2. Le changement de CRF-R2 a été inhibée par le traitement antagoniste sélectif. Nous avons montré que des modifications des récepteurs n'ont pas été détectés et ne peut pas être mesurée en utilisant les standards techniques 2D multispectrale. La possibilité d'étudier des images 3D complexes est essentiel d'intégrer la complexité des paramètres biologiques pour l'analyse morphométrique. N.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
De rein embryonnaire humain (HEK293)	American Type Culture Collection	CRL-1573
Eagle modifié par Dulbecco (DMEM)	Invitrogen	11965118
Sérum foetal bovin (FBS)	Invitrogen	SH30070.03
AlexaFluor-488 (IgG2b)	Invitrogen	A-11001
Anticorps monoclonal anti-HA.11 (IgG 1)	Covance	16B12
DAPI	Vector Laboratories	H-1200	;
CRF	Sigma	C2917
Antisauvagine-30 (AS-30)	Sigma	A4727