Une technique appelée C Omprehensive M Icroarray P (COMPP) pour la caractérisation des glycanes paroi cellulaire végétale est décrit. Cette méthode combine la spécificité des anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes définis glycane-avec une plate-forme puces à ADN miniature analytique permettant le dépistage de l'apparition glycane dans un large éventail de contextes biologiques.
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Article de méthode
Profilage Glycan des polymères végétaux de la paroi cellulaire en utilisant Microarrays
Dans cet article
Résumé
Résumé
Parois des cellules végétales sont des matrices complexes de glycanes hétérogènes qui jouent un rôle important dans la physiologie et le développement des plantes et de fournir les matières premières pour les sociétés humaines (par exemple, les industries du bois, du papier, du textile et de biocarburants) 1,2. Cependant, la compréhension de la biosynthèse et la fonction de ces composants reste difficile.
Glycanes parois cellulaires sont chimiquement et conformation diverse en raison de la complexité de leurs blocs de construction, les résidus glycosylés. Ces liens forment en des positions multiples et diffèrent en structure cyclique, la configuration anomérique ou isomérique, et en plus, sont substitués par un réseau de résidus de sucre non. Composition Glycan varie en cellule et / ou types de tissus ou même des sous-domaines d'une seule cellule paroi 3. En outre, leur composition est également modifiée au cours du développement 1, ou en réponse à des signaux environnementaux 4.
En exprocessus de 2.000 gènes ont des parois cellulaires végétales sont des matrices complexes de glycanes hétérogènes été prévus pour être impliqués dans la biosynthèse de la paroi cellulaire et la modification glycane dans 5 Arabidopsis. Cependant, relativement peu de gènes de biosynthèse ont été fonctionnellement caractérisé 4,5. Approches de génétique inverse sont difficiles parce que les gènes sont souvent exprimés de façon différentielle, souvent à des niveaux faibles, entre les types de cellules 6. En outre, des études mutants sont souvent entravées par la redondance génique ou les mécanismes compensatoires pour assurer la fonction appropriée paroi cellulaire est maintenu 7. Ainsi, de nouvelles approches sont nécessaires pour caractériser rapidement la diversité des structures des glycanes et de faciliter approches de génomique fonctionnelle de biosynthèse de la paroi cellulaire et la compréhension de modification.
Les anticorps monoclonaux (Acm) 8,9 ont émergé comme un outil important pour déterminer la structure des glycanes et la distribution des plantes. Ceux-ci reconnaissent distInTC épitopes présents dans les principales catégories de glycanes parois cellulaires végétales, y compris les pectines, les xyloglucanes, les xylanes, les mannanes, les glucanes et arabinogalactanes. Récemment, leur utilisation a été étendue à des expériences de criblage à grande échelle pour déterminer l'abondance relative des glycanes dans un large éventail de plantes et types de tissus simultanément 9,10,11.
Nous présentons ici une méthode de dépistage basé sur un microréseau glycane appelé complète Microarray Polymer profilage (COMPP) (figures 1 et 2) 10,11 qui permet de multiples échantillons (100 sec) pour être contrôlés au moyen d'une plate-forme de puces à ADN miniaturisé avec le réactif réduit et des volumes d'échantillon. Les signaux de place sur la puce peuvent être formellement quantifié pour donner données semi-quantitatives sur glycane épitope événement. Cette approche est bien adaptée à suivre l'évolution des glycanes dans des systèmes biologiques complexes 12 et fournissant un aperçu global de la composition de la paroi cellulaire en particulier lorsque les connaissances antérieures of ce n'est pas disponible.
Protocole
1. Collection de tissus et de préparation
- Prélever 100 mg de poids frais des tissus végétaux (un minimum de 10 mg de poids sec) dans au moins trois exemplaires pour chaque tissu d'intérêt. Les étapes suivantes décrivent la préparation de matériau de paroi cellulaire des tissus végétatifs. Dans le cas des tissus de réserve, non désiré par voie enzymatique de l'amidon est enlevé avant de procéder à l'extraction des polymères pariétaux comme décrit précédemment 13.
- Homogénéiser les échantillons en une fine poudre avec de l'azote liquide à l'aide d'un Qiagen TissueLyser II, avec 24 jeux d'adaptateurs de tubes et....
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Résultats
L'abondance relative des glycanes dans six types de tissus (filaments anthère, pollen, les ovaires, les pétales, les sépales et les stigmates) de Nicotiana alata fleurs a été déterminée à l'aide COMPP. La figure 3a montre un micro-réseau représentant que a été sondé avec mAb spécifique pour JIM5 partiellement (faible) methylesterified homogalacturonan (HG), un épitope qui se produit sur des polysaccharides pectiques 14. L'épitope JIM5 est détectée dans les extraits CDTA de tous les tiss.......
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Discussion
COMPP est une méthode rapide et sensible pour le profilage de la composition glycane de centaines d'origine végétale échantillons dans une affaire de jours. Cette méthode vient compléter les déjà bactériennes ou de mammifères plates-formes de tableaux glycanes de criblage à haut débit des interactions avec les hydrates de carbone glycane protéines de liaison telles que les lectines, des récepteurs et anticorps 16. Avec une grande diversité de sondes disponibles pour détecter glycanes paroi cellulaire, il .......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
IEM tient à remercier le Conseil de recherches en danois (FTP et FNU) pour le financement. ERL reconnaît le soutien d'une subvention ARC DP. AB reconnaît le soutien de l'ARC Centre d'excellence en parois cellulaires des végétaux subvention.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| 3 mm de tungstène Carbure de perles | Qiagen | 69997 | |
| Microtubes de collecte (1,2 mm) | Qiagen | 19560 | 1,5 ml microtubes peuvent également être utilisés |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 billes de verre mm | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| L'oxyde de cadmium | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoéthane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Membrane de nitrocellulose (0,22 um taille des pores) | GE-Water & Process Technologies | EP2HY00010 | différentes membranes à pores de taille sont adaptés à différents types de broches |
| Xact II de puces à ADN robots | Labnext | 001A | l'Xact II robot a été équipé d'une coutume en plaque 20 x 20 cm en céramique à laquelle la membrane de nitrocellulose est attaché |
| Xtend broches microarray RM | Labnext | 0037-350 | broches doivent être adaptés à taches sur des membranes |
| Plaques 384 puits de microtitration (polypropylène) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycanes anticorps monoclonaux | Sondes de plantes / CarboSource / Biosupplies | Sites Web; PlantProbes ( www.plantprobes.net ), Carbosource (ww.carbosource.net "target =" _blank "> www.carbosource.net) et Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ). | |
| Anti-Rat IgG (molécule entière) - anticorps peroxydase produite chez la chèvre. | Sigma | A9037 | le type d'anticorps secondaire dépend de l'anticorps primaire utilisé (par exemple soulevé chez le rat, la souris de chèvre etc,). |
| SIGMA FAST 3,3 '-diaminobenzidine comprimés | Sigma | D4293 | le type de développement réactif dépend des anticorps secondaires utilisés et la méthode de détection (colorimétrique ou chemiluminecent). |
| Substrat SuperSignal West Pico chimiluminescence | Thermoscientific | 34080 | voir ci-dessus |
| Xplore logiciel de traitement d'image | LabNext | 008 | types de logiciels avec de nombreux outils automatiques de maillage sont disponiblespour mesurer la valeur de pixel de taches de biopuces. |
| Polysaccharides végétaux | Sigma / Megazyme |
Références
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol.
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Réimpressions et autorisations
