Un test pour évaluer le comportement des explants cellulaires du mésenchyme crânienne

Résumé

Le mésenchyme crânienne subit des mouvements morphogénétiques dramatiques qui fournit sans doute une force motrice pour l'élévation des plis neuraux ^1,2. Nous décrivons ici un simple Ex vivo Explantation d'essai pour caractériser les comportements cellulaires du mésenchyme crânienne pendant la neurulation. Ce test a de nombreuses applications, y compris se prêter à des manipulations pharmacologiques et des analyses d'imagerie en direct.

Résumé

Le système nerveux central est dérivé de la plaque neurale qui subit une série de mouvements morphogénétiques complexes résultant dans la formation du tube neural dans un processus connu sous le nom neurulation. Au cours de la neurulation, la morphogenèse du mésenchyme qui sous-tend la plaque neurale est censé conduire neurones élévation fois. Le mésenchyme crânienne est composée du mésoderme paraxial et les cellules de la crête neurale. Les cellules du mésenchyme sous la forme du crâne un maillage pourous composée de cellules étoilées en forme et le brassage de la matrice extracellulaire (ECM) brins qui soutiennent les plis neuraux. Au cours de la neurulation, le mésenchyme crânienne subit des réarrangements stéréotypes résultant de leur expansion et ces mouvements sont censés fournir une force motrice pour l'élévation fois neural. Cependant, les voies et les comportements cellulaires qui sous-tendent la morphogenèse mésenchyme crânienne restent mal étudiées. Les interactions entre l'ECM et les cellules des crâniens mésenchyme sous-tendent thescomportements cellulaires e. Nous décrivons ici un test ex vivo simples explant mis au point pour caractériser les comportements de ces cellules. Ce test est modifiable à des manipulations pharmacologiques pour disséquer les voies de signalisation impliquées et les analyses d'imagerie en direct pour mieux caractériser le comportement de ces cellules. Nous présentons une expérience représentative démontrer l'utilité de cet essai pour caractériser les propriétés migratoires du mésenchyme crânienne sur une variété de composants de la MEC.

Introduction

Fermeture du tube neural dans la région crânienne se produit entre embryonnaire jour 8,5 (E8.5) et de 9,5 chez l'embryon de souris. Le défaut de bien fermer le tube neural dans les résultats de la tête dans l'anencéphalie, une malformation congénitale structurelle commune chez l'homme et est incompatible avec la vie. Les forces qui animent céphalique fermeture du tube neural sont générés à la fois du tissu nerveux lui-même et l'épiderme environnant et le mésenchyme ^3. En particulier, l'expansion du mésenchyme crânienne est considérée comme essentielle pour l'élévation de ^l'1,2 crânienne plis de neurones. Le mésenchyme crânienne est riche en protéines de la MEC en particulier des protéines glycosylées comme protéoglycanes de sulfate de chondroïtine sulfates d'héparine, et ^4-8 hyaluronate.

Contrairement à l'embryon de poulet, où les cellules de la crête neurale émigrer dans le tube neural dorsal après la fermeture du tube neural, la crête neurale dans l'embryon de souris migre en même temps que les plis de neurones commencent à rise (après le stade de 5 somites). Ainsi, pendant la neurulation chez l'embryon de souris, le mésenchyme crânienne est composée de cellules dérivées de la crête neurale et le mésoderme paraxial. De la crête neurale et les populations mésoderme paraxial sont induits à différents moments dans le développement; localisés dans des positions différentes dans l'embryon et se développer en différentes structures ^9,10. Le mésoderme paraxial provient de la ligne primitive et migre vers la région antérieure de l'embryon à la base de la plaque neurale présomptive. La crête neurale est induite au niveau de la jonction de la plaque neurale et l'ectoderme épidermique, subit une transition épithélio mésenchyme et délamine juste avant l'élévation de pliage neural chez l'embryon rongeur. Les cellules de la crête neurale migrent le long des chemins stéréotypés dans le mésoderme paraxial subectodermal à l'arc branchial, frontonasal et le mésenchyme péri-oculaire. Le mésoderme paraxial contribuera à certains des os de la voûte du crâne et des muscles du visage, tandis que ee de la crête neurale contribuera à d'autres os du crâne et du visage, en plus de nerfs crâniens ^9-11. Le mésoderme paraxial et les lignages de la crête neurale peut être différemment marqué par la Mesp1-cre et Wnt1-cre lignées de souris transgéniques, respectivement ^9.

Le rôle essentiel du mésenchyme crânienne en fermeture du tube neural a été déduite à partir d'expériences où le traitement des embryons de rongeurs avec ECM agents de rupture telles que l'hyaluronidase, chondroïtinase ABC, héparitinase ou diazo-oxo-norleucine (DON) au cours de la neurulation tube de fermeture atteinte neuronale ^{7, 12-14.} Dans ces expériences, l'analyse histologique de sections statiques après la neurulation révélé dysmorphogeneis associés au crânienne mésenchyme ^7,12-14. Toutefois, étant donné que l'agent tératogène eu accès à de multiples tissus, il reste à déterminer si le mésenchyme crânienne est vraiment le tissu cible. À l'appui de la conclusion que ce tissuest essentielle pour la neurulation, le mésenchyme crânienne semble anormale sur des analyses histologiques dans certains mutants de souris avec une exencéphalie ^15-17. Pourtant, dans la plupart des cas, l'effet de la mutation sur le comportement cellulaire du mésenchyme crânienne n'a pas été abordée.

Nous avons mis au point un test ex vivo des explants d'examiner directement la conséquence d'une mutation génétique ou manipulation pharmacologique sur le comportement des cellules mésenchymateuses du crâne ^15. Ce test est similaire à celle publiée par Tzahor et al 2003 pour accéder au potentiel de différenciation du mésenchyme crânienne qui sous-tend les ¹⁸ rhombomères sauf que nous avons modifié la dissection explant d'étudier les propriétés migratoires des populations plus antérieures du mésenchyme crânienne qui sous-tendent l'neurale antérieure plaque. Notre méthode est également une variante de tests effectués dans des explants l'embryon de poulet pour analyser le comportement migratoire de la crête neurale avec kedifférences y. Préparations précédentes ont explanté la crête neurale ou le mésoderme paraxial plus postérieure ^19,20. En outre, lors de l'élévation fois neural chez l'embryon de poulet, de la crête neurale n'a pas encore émigré du tube neural dorsal et donc explants du mésoderme paraxial antérieure n'aurait pas contenir des cellules de la crête neurale. Dans notre essai, des explants de mésenchyme crâniens constitués de mésoderme paraxial, de la crête neurale et l'ectoderme de surface sont préparés et plaqué sur un substrat. La manipulation expérimentale y compris l'isolement des explants de mutants génétiques, plaquant sur des explants ECM différent ou traitements pharmacologiques peuvent être effectuées. Les cellules migrent de l'explant et la distance, le nombre et le comportement peuvent être analysés et comparés entre les groupes de traitement. En outre, cette préparation est modifiable à l'analyse de la migration cellulaire par des techniques d'imagerie en direct. Après l'expérience des migrations, des explants peuvent être fixes et soumis à des analyses immunohistochimiques de la fourrurether élucider l'effet des traitements. Dans l'ensemble, le protocole présenté ici est un test ex vivo simples pour étudier le comportement du mésenchyme crânienne. Comme une expérience représentative, nous utilisons ce test d'étudier la migration du mésenchyme crânienne sur différents substrats extracellulaires.

Protocole

1. Préparation de plats ECM Culture enrobées ou Lamelles

1. Préparer la solution mère en dissolvant ECM ECM substrat dans du PBS (Dulbecco saline tamponnée au phosphate, Invitrogen, 14040-133 #). Filtrer à l'aide d'une seringue 0,2 mm filtre (VWR, # 28145-495) et le gel en aliquotes à -80 ° C.
2. Diluer la solution mère ECM dans du PBS à la concentration souhaitée. Pour MaxGel, diluer dans du DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Invitrogen, 11995-065 #).
3. Si immunofluorescence sera effectuée, stériliser 12 lamelles de verre circulaires mm (VWR, # 89015-724) par trempage dans de l'éthanol et laisser sécher à l'air. Cela devrait être fait dans la hotte laminaire stérile. Si immunofluorescence ne sera pas effectuée passez à l'étape 1.5.
4. Lieu stérilisés lamelles dans chaque puits d'une plaque à 24 puits (Corning, # 3526).
5. Ajouter 0,5 ml de solution diluée de substrat dans chaque puits de plaque à 24 puits et incuber à température ambiante pendant 3 heures.
6. Aspirer la solution ECM et laver three fois dans du PBS.
7. Aspirer PBS et l'utiliser immédiatement ou enveloppés dans du parafilm et conservés à 4 ° C pendant 2 semaines.

2. Préparation des outils de dissection

Sylgard plaques avec du charbon ajoutée sont préparés selon le protocole du fabricant. Le fond noir résistant de ces plaques fournit un support pour mettre le doigt sur l'embryon et la couleur offre un bon contraste qui facilite la visualisation de l'embryon translucide.

1. Pour préparer les plaques pèsent directement dans un bécher de tri-versez-les sur une balance 150 Référence g Un liquide 15 g Partie B et 1 g de poudre de charbon (World Precision Instruments, # SYLG184). Mélanger à l'aide d'un bâton de popsicle en bois ou abaisse-langue. Verser dans un verre en plastique ou des boîtes de 100 cm. Utilisez une torche au butane petite tenue environ 10 à 12 centimètres au-dessus des plats pour brûler les bulles. Placer les couvercles sur les plaques et laisser reposer pendant au moins 24 heures à configurer.
2. Pour préparer les outils de dissection, insérez une goupille minuties (0,1 mm DIAMETREr) dans un porte-broche (outils fins scientifiques, # # 26002-10 et 26018-17, respectivement) aussi sur des aiguilles de calibre 26 (BD, # 309597) pliée à angle droit à l'aide d'une pince peut être utilisée comme instruments de dissection. Aiguisé étudiants Dumont # 5 Forceps (Outils Fine Science, # 91150-20) à l'aide d'une pierre à aiguiser (Beaux-outils scientifiques, # 29008-22).
3. Stériliser tous les outils de dissection avec de l'éthanol à 70% avant l'utilisation.

3. Collecte des embryons

1. Euthanasier la souris chronométré enceinte à 8,5 coïtum jours après conformément à la réglementation des animaux usage des comités et enlever l'utérus.
2. Utérus Placer dans un plat de Petri en plastique avec du PBS stérile.
3. Laver l'utérus une fois avec du PBS stérile.
4. Sous un microscope à dissection retirez soigneusement embryon à partir deciduas en utilisant une paire de pinces.
5. Retirer les membranes extra-embryonnaires et d'économiser pour le génotypage si nécessaire.
6. Embryon au stade en comptant somites. Les étapes idéales pour faire des explants d'analyser cellulaire behAvior fois lors de l'élévation de neurones serait entre les 6 et 10 somites stades lorsque les plis neuraux commencent tout juste à élever et avant la morphogenèse majeur du mésenchyme crânienne a lieu.
7. Laver embryon dans du PBS. Placer dans une plaque noire avec du DMEM Sylgard qui ne contient pas de rouge de phénol (Invitrogen, 21063-029 #). Retirer les membranes extra-embryonnaires et d'économiser pour le génotypage si nécessaire.

4. Préparation des explants

1. Recentrer le microscope au grossissement le plus haut possible sur la zone de tête de l'embryon.
2. Faire des coupes avec une aiguille à dissection dans chaque main. Utilisez une aiguille pour maintenir le tissu en place et l'autre pour faire des coupes.
3. Couper la tête de l'embryon avant des rhombomères.
4. Couper le long de la ligne médiane de la tête coupent en deux moitiés égales.
5. Couper autour des confins de la tête et la ligne médiane. Ces réductions vont retirer la crête premigratory et de l'ectoderme de surface à la frontière extérieure etla plaque préchordale sur la ligne médiane. Le reste du tissu sera l'explant et contiendra la migration neuronale crête crânienne, mésoderme paraxial et de l'ectoderme de surface.
6. Comme le tissu est coupé, retirer les débris disséqué de l'antenne à l'aide d'une pipette Pasteur stérile. Cela évite la confusion de l'explant avec les débris disséqués.
7. Lavez délicatement l'explant par pipetage de haut en bas avec une pointe de pipette 20 ul et pipetman. Cela permettra d'éliminer les cellules faiblement attachées et prévenir les bords dentelés sur les explants.
8. Prenez soigneusement chaque explant dans environ 10 ul de liquide à l'aide d'une pipette 20 ul et pipetman et place au centre de la culture puits enduit.
9. Ajouter 20 ul de milieu de culture supplémenté avec 15% de FBS pour couvrir l'explant.
10. Plaque lieu dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (5% de CO _2, 37 ° C) pendant 1-2 heures pour permettre l'explant à fixer au fond de la boîte. Afficher périodiquement afin de s'assurer que l'explant ne sècheDépart.
11. Lorsque l'explant a attaché, ajouter prudemment dans chaque puits 250 ul DMEM supplémenté avec 10% de FBS qui a été chauffé à 37 ° C dans un bain-marie. Une fois les explants ont attaché ils ne bougeront pas lorsque la plaque est agitée doucement sous le microscope.
12. Retour plat pour culture de tissu incubateur.
13. Après 24 h, les explants seront solidement attachées et les cellules commencent à émigrer. À ce moment agents pharmacologiques peut être ajouté au milieu.
14. 48 heures après l'étalement, les cellules ont migré à partir des explants. La distance migré peuvent être visualisées et imagée. En général, nous arrêter la culture à ce point depuis explants commencent à montrer des signes de viabilité a diminué de plus longues incubations. Un colorant vital comme l'acridine orange ou bleu trypan peuvent également être utilisés pour vérifier la viabilité de l'explant.
15. À ce stade, les images peuvent être acquises à documenter la distance et le nombre de cellules qui migrent à partir de l'explant. Alternativement, si explants ont été étalées sur des lamelles,ils peuvent être fixés et analyses immunohistochimiques réalisées pour visualiser les protéines d'intérêt.

Les étapes critiques dans le protocole

1. Couper explants d'environ la même taille.
2. Enlever tous les débris de la plaque de dissection disséquer comme vous dissection afin d'éviter la confusion avec les débris du tissu désiré explantée.
3. Lorsque des explants de placage dans les puits ou sur des lamelles être sûr de placer des gouttelettes de médias avec explant dans le centre de bien.
4. Laissez suffisamment de temps pour explantation attacher avant d'inonder le puits avec les médias.
5. Les conditions de traitement doivent être normalisées pour chaque substrat d'essai et un agent pharmacologique utilisé.
6. Deux explants peuvent être fabriqués à partir de chaque embryon (un à gauche et un à droite du tube neural).
7. Lors du test de migration de cellules de lignées de souris mutantes dans différentes conditions expérimentales, mettre un explant mutant dans le groupe témoin et l'autre dans le groupe traité.

Dépannage

1. Si explants ne parviennent pas à fixer, augmenter le temps alloué pour la fixation. Dans notre expérience, environ la moitié des explants de ne pas attacher et plus explants respecter plus efficacement.
2. Si explants joindre à la périphérie du puits, ils seront difficiles à l'image. Veillez à placer dans des explants centre du puits.
3. Idéalement explants sera approximativement la même taille. Cependant, les différences dans la taille explant peut être corrigée à l'aide d'au diamètre des explants comme un facteur de correction lorsque quanitating migrations de cellules à partir d'explants.
4. En cas de contamination être sûr stériles conditions de travail sont utilisés. Tous les outils et les surfaces de travail doivent être stérilisés avec de l'éthanol à 70%. Pipettes et des boîtes de Petri doivent être nouveaux et stérile.
5. Si explants se perdent lors de la dissection, de supprimer régulièrement les débris pour éviter de perdre explant.
6. Maîtriser la dissection prend du temps et demande de la pratique. Optimal grossissement, outils de dissection tranchants et aiguilles d'aide.

Résultats

L'apparition de cellules qui migrent à partir d'explants mésenchyme crâniens est montré dans la figure 2. Nous avons testé de migration sur des substrats ECM différents qui sont présents dans le mésenchyme crânienne pendant neurulation y compris la fibronectine (100 mg / ml, Sigma # F1141), la laminine (100 mg / ml, Sigma # L2020), MaxGel ECM (1:500 dilution dans du DMEM , Sigma # e0282) et l'acide hyaluronique (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Les cellules ne parviennent pas à migrer de l'explantation si aucun ECM est présent (données non présentées) et tous les substrats testés charge la migration des cellules. À la fois la forme et les dimensions des cellules qui migrent à partir des explants dépend du substrat. Cela devrait que des études antérieures démontrent que les forces mécaniques générées par l'interaction des cellules avec ECM différents affectent à la fois la forme et les propriétés migratoires des cellules ^21.

Figure 1. Préparation des explants. (A) Pour préparer les explants, E8.5 embryons sont disséqués à partir deciduas et les tissus extra-embryonnaires. (B) les chefs d'embryons sont disséqués à partir de la partie antérieure du corps aux rhombomères. Explants sont préparés en éliminant les tissus à partir de la ligne médiane et les bords extérieurs de la tête pour retirer la plaque préchordale à la ligne médiane et de la crête neurale et l'ectoderme premigratory surface à la frontière, respectivement. (C) Les explants sont préparés en coupant le tissu à partir de la ligne médiane et les bords extérieurs de la tête pour retirer la plaque préchordale à la ligne médiane et de la crête neurale et l'ectoderme premigratory surface aux frontières. (D) Les explants sont placés dans un petit volume de médias sur des plats revêtus ECM / lamelles et a permis de fixer, avant l'ajout de médias.

Figure 2. Les explants de migration des cellules mésenchymateuses du crâne à partir d'explants étalées sur des substrats différents. Ont été étalées sur la fibronectine, laminine, MaxGel ECM ou acide hyaluronique et photographiées après 48 heures de culture. Taille bar = 200 mm.

Discussion

La méthode appliquée ici permet un test puissant pour étudier le comportement des cellules mésenchymateuses crâniens. En plus des analyses statiques présentées ici, de vivre des expériences d'imagerie en fond clair ou en combinaison avec l'expression des protéines GFP-marqués peuvent être utilisées pour étudier le comportement des cellules en temps réel lors de leur migration à partir de l'explant. Pour les expériences d'imagerie en direct, des explants peuvent être étiquetés avec Dil ou de différencier la migration des crêtes neurales à partir du mésoderme paraxial, ROSA-YFP; Mesp1-cre ou ROSA-YFP; Wnt1-cre ou d'autres lignées transgéniques pourraient être utilisés. Crâniens mésenchyme-ECM interactions peuvent aussi être examinées en utilisant ce test explant. Ici on explants de plaque sur des substrats ECM différents qui sont présents dans le mésenchyme crânienne de montrer que les cellules migrent sur les différents degrés et en ce que le ECM influe sur la morphologie des cellules. En outre, les explants sont noyées dans une matrice à trois dimensions pour ouvrir les comportements des cells dans ce contexte. Ce test explant est modifiable à l'analyse de l'effet des manipulations génétiques et pharmacologiques sur les comportements mésenchyme crâniens pour analyser des signaux intrinsèques et extrinsèques qui peuvent réguler et modifier la migration. Par exemple, nous avons utilisé ce test dans nos études de discerner le rôle de l'excès de sécrétion de la protéine Hsp90 dans les comportements anormaux cellulaires dans Hectd1 mésenchyme crânienne mutant ^15. Dans ces expériences, nous avons traité avec des explants de Hsp90 anticorps anti-Hsp90, protéines, geldanamycine et DMA (amelioride diméthyl) pour bloquer la sécrétion de la protéine Hsp90 de démontrer que le comportement anormal de cellules mutantes Hectd1 est due à l'excès extracellulaire de Hsp90 ^15. Des approches similaires pourraient être utilisées pour pharmacologiquement disséquer les voies supplémentaires qui sous-tendent la morphogenèse normale ou anormale du mésenchyme crânienne. Une fois que le test est terminé, les explants et des cellules migratrices peuvent être analysés par une multitude de méthodes. Par exemple, c immunohistochimique des analysesun être utilisées pour examiner la localisation des protéines essentielles pour les mouvements cellulaires. Analyses du transcriptome pourrait également être utilisée pour déterminer la façon dont les traitements affectent l'expression des gènes.

Une limite importante de cette technique est que ce n'est pas le comportement du modèle en trois dimensions comme ils se produisent in vivo. Modification du protocole où explants sont noyées dans une matrice tridimensionnelle (par exemple matrigel) ainsi que l'expression de protéines fluorescentes marquées compartiments cellulaires pourraient être employées nécessaire d'aborder cette question. Même si ces modifications ont été effectuées, d'autres expériences de corréler les comportements observés dans cet essai ex vivo avec celles in vivo serait nécessaire. D'autres limitations comprennent le nombre d'embryons requis pour générer des nombres suffisants pour générer des données statistiquement significative. Plus important encore, la dissection est relativement simple, elle exige la pratique à maîtriser.