Particules d'adénovirus sont conçus pour contenir soit le naturel azidohomoalanine analogue d'acide aminé ou le sucre azido O-GlcNAz. Le groupe azide de chaque chimiosélective est ligaturé au moyen des réactions «clic» chimie sous forme de moyens de modification de surface virale.
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Article de méthode
Modification des surfaces chimiosélective virales via Click Chemistry Bioorthogonal
Dans cet article
Résumé
Résumé
La modification de particules virales a reçu une quantité importante de l'attention pour son énorme potentiel pour influer sur la thérapie génique, applications oncolytiques et le développement de vaccins. 1,2,3 Les approches actuelles de la modification de surfaces virales, qui sont la plupart du temps basée sur la génétique, souffrent souvent de l'atténuation transduction de la production de virus, d'infectiosité et cellulaire. 4,5 En utilisant la chimie clic chimiosélective, nous avons développé une approche alternative simple qui permet d'éviter ces problèmes tout en restant à la fois très souple et accessible. 1,2
L'objectif de ce protocole est de démontrer l'efficacité de l'aide click chemistry bioorthogonal de modifier la surface de l'adénovirus de type 5 particules. Ce processus en deux étapes peut être utilisé à la fois thérapeutique 1 ou analytiquement, 2,6, car il permet pour la ligature chimiosélective de molécules de ciblage, de colorants ou d'autres molécules d'intérêt sur des protéinespré-marquée avec balises azide. Les trois principaux avantages de cette méthode sont que (1) marquage métabolique démontre peu ou pas d'impact sur l'aptitude virale, 1,7 (2) un large éventail de ligands effecteurs peuvent être utilisés, et (3), il est remarquablement rapide, fiable et facile d'accès. 1,2,7
Dans la première étape de cette procédure, les particules d'adénovirus sont soit produite portant azidohomoalanine (Aha, un substitut méthionine) ou le sucre non naturelle O-liée N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), qui contiennent tous deux l'azoture (-N 3) fonctionnelle groupe. Après purification des particules virales azoture modifiés, une sonde alcyne contenant le fragment fluorescent TAMRA est ligaturé de manière chimiosélective aux protéines pré-étiquette ou glycoprotéines. Enfin, une analyse SDS-PAGE est effectuée pour démontrer la ligature réussi de la sonde sur les protéines de la capside virale. L'incorporation Aha est montré à étiqueter tous les capside viraleprotéines (Hexon, Penton et fibre optique), tandis que les résultats d'incorporation O-GlcNAz dans l'étiquetage des fibres seulement.
Dans ce domaine en pleine évolution, de multiples méthodes pour l'azoture de-alcyne ligature ont été développés avec succès, mais seuls les deux nous avons trouvé pour être plus pratique sont mises en évidence ci - souche promu azide-alcyne cycloaddition (SPAAC) et de cuivre-catalysée azide-alcyne cycloaddition (CuAAC) sous atmosphère désoxygénée.
Protocole
Se reporter au tableau 1 pour la préparation de tous les médias, les tampons et les solutions mentionnées dans le présent protocole.
1. Production de Aha-Labeled adénovirus
- Préparer onze de 100 mm boîtes de culture tissulaire de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK 293) maintenus dans des cellules HEK 293 milieu de croissance cellulaire (voir tableau 1) à 37 ° C jusqu'à ce qu'ils aient atteint 80 à 90% de confluence. (Remarque:. Cultures avec plus de 90% de confluence peut être difficile d'infecter et ne peuvent pas produire des virus comme souhaité)
- Desserrer les ....
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Discussion
Le développement de la réactions cliquez sur chimiosélectives et de bioorthogonal, y compris ceux de la des azides, des est un zone de rapidement-en évolution de la recherche, et par la suite il n'y a un certain nombre croissante de ces réactions de choisir à partir pour les applications bioconjugaison. Nous avons limité la portée de ce protocole d'inclure seulement deux méthodes qui ont été choisis en raison de leur utilité dans notre propre laboratoire et de la disponibilité commerciale de tous les réactifs. <.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Nous tenons à remercier la NSF pour le financement (CBET-0846259).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| Adénovirus de type 5 (Ad5) contenant un transgène GFP | BCBC | 391 | |
| De rein embryonnaire humain (HEK 293) des cellules | ATCC | CRL-1573 | |
| Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), glycémie élevée | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbecco Modified Eagle Médium, pas de méthionine, la cystéine ne (DMEM-Met / Cys-), glycémie élevée | Invitrogen | 21013-024 | |
| Bovine sérum de veau | Invitrogen | 16170-078 | |
| La pénicilline - streptomycine 100 × Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0,5% de trypsine-EDTA (10 ×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm boîte de culture cellulaire, culture de tissus de polystyrène traité | BD Falcon | 353003 | |
| Culture cellulaire incubateur à CO 2 | |||
| Hémocytomètre | |||
| Enceinte de sécurité biologique | |||
| Seringue stérile de filtre (0,2 um, l'acétate de cellulose) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) | |
| Avanti JE centrifugeuse | Beckman Coulter | 369001 | |
| Tubes coniques (50 ml, stérile) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, à paroi mince, ultra-Clair, 13,2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrifugeuse équipé d'un 41 SW et SW 60 rOtor | Beckman | ||
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1,5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifuger 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep colonnes de gel de spin de filtration | Séparations Princeton | CS-901 | |
| Aiguille stérile, de calibre 18 | |||
| L'azote gant de sac (si CuAAC désoxygénée doit être exécuté) | |||
| Vase de Dewar | |||
| L'azote liquide | |||
| Cellule d'électrophorèse | |||
| Scanner gel fluorescent | |||
| Prêt gel de Tris-HCl gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracétylé N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophénanthroline disulfonique (BDA) de disodium | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | |||
| Le méthanol | |||
| Tris base (tris (hydroxyméthyl) aminométhane) | |||
| Phosphate disodique (Na2 HPO 4) | |||
| Tampon phosphate salin (PBS) | |||
| HCl 1M | |||
| Glycérol | |||
| Albumine de sérum bovin | |||
| L-cystéine | |||
| L-méthionine | |||
| SDS (dodécyl sulfate de sodium) | |||
| Le 2-mercaptoéthanol | |||
| Glycine | |||
| Bleu de bromophénol | |||
| Chlorure de césium (CsCl) | & Nbsp; | ||
| De cuivre (I) du bromure de (CuBr) | |||
| Chlorure de calcium (CaCl 2) | |||
| Chlorure de potassium (KCl) | |||
| Chlorure de magnésium (MgCl 2) | |||
| Chlorure de sodium (NaCl) | |||
| Alcyne sonde pour CuAAC * | |||
| TAMRA acétyléniques | Invitrogen | T10183 | |
| Purée de sonde pour alcyne * SPAAC | |||
| TAMRA DIBO acétyléniques | Invitrogen | C10410 |
* Les vendeurs notables de réactifs de chimie clic et kits comprennent Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Cliquez sur Outils Chimie, et Baseclick. Une variété de colorants alcynes et des ligands de ciblage peut être trouvé dans les catalogues de ces vendeurs.
Références
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S.
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