L'utilisation de Lysotracker pour détecter la mort cellulaire programmée dans les embryons et la différenciation des cellules souches embryonnaires

Résumé

Nous présentons un protocole simple de visualiser les régions de la mort cellulaire programmée (PCD) dans des embryons de souris et la différenciation de cellules souches embryonnaires cultures (ES) en utilisant un colorant hautement soluble appelée Lysotracker.

Résumé

La mort cellulaire programmée (PCD) survient chez les adultes pour maintenir l'homéostasie des tissus normaux et au cours du développement embryologique de façonner les tissus et organes ^1,2,6,7. Au cours du développement, les produits chimiques toxiques ou des altérations génétiques peuvent entraîner une augmentation des PCD ou modifier les modes de CPD entraînant des anomalies du développement et des malformations congénitales ^3-5. Pour comprendre l'étiologie de ces défauts, l'étude des embryons peut être complété par des tests in vitro qui utilisent différencier souches embryonnaires (ES) cellules.

L'apoptose est une forme bien étudiée de la CPD qui implique à la fois intrinsèque et extrinsèque de signalisation pour activer la cascade enzyme caspase. Modifications cellulaires caractéristiques comprennent bourgeonnement de la membrane, rétrécissement nucléaire et fragmentation de l'ADN. D'autres formes de PCD ne comportent pas l'activation des caspases et peut être le résultat final de l'autophagie prolongée. Quelle que soit la voie PCD, les cellules mourantes doivent être enlevés. Chez l'adulte, les cellules immunitaires perform cette fonction, tandis que chez les embryons, où le système immunitaire n'a pas encore développé, l'élimination se fait par un autre mécanisme. Ce mécanisme implique les cellules voisines (appelés «non-professionnels» phagocytes) prennent une phagocytaire rôle qu'ils reconnaissent la "eat me" signal sur la surface de la cellule mourante et engloutir ^l'8-10. Après l'engloutissement, les débris est amené vers le lysosome de la dégradation. Ainsi, indépendamment du mécanisme de PCD, une augmentation de l'activité lysosomale peut être corrélée avec la mort cellulaire accrue.

Pour étudier PCD, un test simple de visualiser les lysosomes des tissus épais et multicouches cultures de différenciation peut être utile. Lysotracker colorant est une molécule très soluble petit qui est retenu dans des compartiments subcellulaires acides tels que ^l'11-13 lysosome. Le colorant est absorbé par diffusion et par la circulation. Depuis la pénétration n'est pas un obstacle, la visualisation de la CPD dans les tissus épais et multicouches cultures est possible ^12,13 14, est limitée à de petits échantillons, coupes histologiques et des cultures monocouches parce que la procédure nécessite l'entrée / la perméabilité d'un terminal transférase.

Contrairement aux Bleu d'aniline, qui diffuse et est dissous par des solvants, Lysotracker Rouge MDN-99 est réparable, lumineux et stable. La coloration peut être visualisé par microscopie confocale fluorescente ou standard dans l'ensemble du montage ou de l'article à l'aide aqueux ou à base de solvant milieux de montage ^12,13. Ici, nous décrivons les protocoles utilisant ce colorant à regarder la CPD dans des conditions normales et sonores embryons de souris hérisson nulles. En outre, nous démontrons l'analyse de la CPD dans la différenciation des cultures de cellules ES et de présenter une méthode de quantification simple. En résumé, la coloration Lysotracker peut être un excellent complément à d'autres méthodes de détection de la CPD.

Protocole

1. Coloration Lysotracker des embryons de souris

1. Générer des embryons de souris en plaçant les jeunes (5-6 semaines) femelles dans des cages goujons mâles. Surveiller les matins suivants pour l'apparition d'un bouchon vaginal indiquant que l'accouplement a eu lieu. Si la femelle est enceinte, à midi ce jour-là est appelé 0,5 dpc (coït jours après). La procédure présentée ici est idéal pour les embryons 13.7 dpc.
2. Le jour embryonnaire d'intérêt, euthanasier de la femelle selon des protocoles approuvés et enlever l'utérus. Retirez les embryons de la caduque dans un plat de Pétri de 10 cm avec Tom Hanks BSS (sans rouge de phénol).....

Discussion

Caractéristiques importantes de l'apoptose comprennent la détection de lésions de l'ADN avec le test TUNEL, ainsi que la détection de l'activité des caspases (détectée par anticorps monoclonaux ou une molécule de liaison tels que ZVAD-fmk), l'observation des changements cellulaires, et la présentation de la phosphatidylsérine (PS ) sur la surface de la membrane (détecté par l'annexine V liaison). Il ya quelques inconvénients à chacune de ces épreuves. Par exemple, le terminal transférase utilisé dans.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise		Numéro de catalogue
Lysotracker Rouge MDN-99	Invitrogen	# L-7528
BSS Hanks	Invitrogen	14025-076
Paraformaldéhyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTEUR	H-1200
DMEM	Cellgro	10 à 013 CV-
Non-acides aminés essentiels	Cellgro	25-025-CI
Pyruvate de sodium	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-mercaptoéthanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II diapositives Chambre (8 puits)	Nalge Nunc International	154534
0,1% de gélatine	Millipore	ES-006-B
PBS de Dulbecco (D-PBS)	Cellgro	21-031 CV-
			Recettes solution Paraformaldéhyde 4% Pour 100 ml: Mélanger 4 g de paraformaldéhyde, 90 ml de H 2 O, et NaOH (une goutte de NaOH 2N). Le paraformaldéhyde ne vais pas entrer dans la solution jusqu'à ce que vous avez ajouté un peu de NaOH pour augmenter le pH. Mélanger et chauffer à 60 ° C jusqu'à ce que toute la poudre est en solution (~ 10-20 min). Ne pas surchauffer. Ajouter 10 ml ~ 10x PBS pour obtenir un volume final de 100 ml. Conserver à -20 ° C en pratique (~ 10 ml ou 40 ml) ~ aliquotes. AVERTISSEMENT: Le paraformaldéhyde dans «jabot» forme (comprimé petites pastilles) est moins poudré et peut donc être mesurée à l'extérieur d'une hotte. Cependant, vous devez toujours porter un masque anti-poussière (N95au moins) pendant la manipulation. EB Culture, des Médias Pour 500 ml EB médias: DMEM: 404,5 ml FBS: 75,0 ml L-Glutamine: 5,0 ml Pénicilline / Streptomycine: 5,0 ml Non-acides aminés essentiels: 5,0 ml Pyruvate de sodium: 5,0 ml β-mercaptoéthanol: 500ul