L'utilisation de Lysotracker pour détecter la mort cellulaire programmée dans les embryons et la différenciation des cellules souches embryonnaires

Résumé

Nous présentons un protocole simple de visualiser les régions de la mort cellulaire programmée (PCD) dans des embryons de souris et la différenciation de cellules souches embryonnaires cultures (ES) en utilisant un colorant hautement soluble appelée Lysotracker.

Résumé

La mort cellulaire programmée (PCD) survient chez les adultes pour maintenir l'homéostasie des tissus normaux et au cours du développement embryologique de façonner les tissus et organes ^1,2,6,7. Au cours du développement, les produits chimiques toxiques ou des altérations génétiques peuvent entraîner une augmentation des PCD ou modifier les modes de CPD entraînant des anomalies du développement et des malformations congénitales ^3-5. Pour comprendre l'étiologie de ces défauts, l'étude des embryons peut être complété par des tests in vitro qui utilisent différencier souches embryonnaires (ES) cellules.

L'apoptose est une forme bien étudiée de la CPD qui implique à la fois intrinsèque et extrinsèque de signalisation pour activer la cascade enzyme caspase. Modifications cellulaires caractéristiques comprennent bourgeonnement de la membrane, rétrécissement nucléaire et fragmentation de l'ADN. D'autres formes de PCD ne comportent pas l'activation des caspases et peut être le résultat final de l'autophagie prolongée. Quelle que soit la voie PCD, les cellules mourantes doivent être enlevés. Chez l'adulte, les cellules immunitaires perform cette fonction, tandis que chez les embryons, où le système immunitaire n'a pas encore développé, l'élimination se fait par un autre mécanisme. Ce mécanisme implique les cellules voisines (appelés «non-professionnels» phagocytes) prennent une phagocytaire rôle qu'ils reconnaissent la "eat me" signal sur la surface de la cellule mourante et engloutir ^l'8-10. Après l'engloutissement, les débris est amené vers le lysosome de la dégradation. Ainsi, indépendamment du mécanisme de PCD, une augmentation de l'activité lysosomale peut être corrélée avec la mort cellulaire accrue.

Pour étudier PCD, un test simple de visualiser les lysosomes des tissus épais et multicouches cultures de différenciation peut être utile. Lysotracker colorant est une molécule très soluble petit qui est retenu dans des compartiments subcellulaires acides tels que ^l'11-13 lysosome. Le colorant est absorbé par diffusion et par la circulation. Depuis la pénétration n'est pas un obstacle, la visualisation de la CPD dans les tissus épais et multicouches cultures est possible ^12,13 14, est limitée à de petits échantillons, coupes histologiques et des cultures monocouches parce que la procédure nécessite l'entrée / la perméabilité d'un terminal transférase.

Contrairement aux Bleu d'aniline, qui diffuse et est dissous par des solvants, Lysotracker Rouge MDN-99 est réparable, lumineux et stable. La coloration peut être visualisé par microscopie confocale fluorescente ou standard dans l'ensemble du montage ou de l'article à l'aide aqueux ou à base de solvant milieux de montage ^12,13. Ici, nous décrivons les protocoles utilisant ce colorant à regarder la CPD dans des conditions normales et sonores embryons de souris hérisson nulles. En outre, nous démontrons l'analyse de la CPD dans la différenciation des cultures de cellules ES et de présenter une méthode de quantification simple. En résumé, la coloration Lysotracker peut être un excellent complément à d'autres méthodes de détection de la CPD.

Protocole

1. Coloration Lysotracker des embryons de souris

1. Générer des embryons de souris en plaçant les jeunes (5-6 semaines) femelles dans des cages goujons mâles. Surveiller les matins suivants pour l'apparition d'un bouchon vaginal indiquant que l'accouplement a eu lieu. Si la femelle est enceinte, à midi ce jour-là est appelé 0,5 dpc (coït jours après). La procédure présentée ici est idéal pour les embryons 13.7 dpc.
2. Le jour embryonnaire d'intérêt, euthanasier de la femelle selon des protocoles approuvés et enlever l'utérus. Retirez les embryons de la caduque dans un plat de Pétri de 10 cm avec Tom Hanks BSS (sans rouge de phénol). Retirer les membranes extra-embryonnaires et ne rincer au moins un avec Tom Hanks BSS pour enlever les tissus extérieurs et le sang.
3. Préparer la solution de coloration Lysotracker embryon (5 mM dans Lysotracker Hanks BSS). Un volume pratique pour 1-2 litres est de 5 ml. Mélanger délicatement pour verser le colorant uniformément.
4. Ajouter embryons à la Solut coloration Lysotracker embryonion dans un microtube ou flacon et incuber à 37 ° C pendant 45 min.
5. Rincer délicatement dans BSS Hanks quatre fois, à 5 min à chaque lavage.
6. Fixer dans du paraformaldéhyde 4% pendant la nuit.
7. Rincer une fois dans BSS Hanks, 10 min, pour supprimer le correctif.
8. Déshydrater à travers une série de méthanol (50%, 75%, 80%, 100%, 5 min chaque étape) afin d'éliminer la coloration de fond. Ceci est important pour obtenir un bon rapport signal sur bruit lors de l'imagerie.
9. A ce stade, vous pouvez stocker les échantillons d'embryons indéfiniment dans le méthanol à -20 ° C, à l'abri de la lumière.

Remarque: Un échantillon de tissu peut être pris à n'importe quelle étape pour le génotypage d'ADN, cependant, il peut être plus commode de prendre un échantillon juste avant le stockage de sorte que jusqu'à cette étape tous les échantillons peuvent être traitées par lots. Prélever un échantillon de tissu à partir de la queue, branche, ou la tête de chaque embryon et mettre tous dans des tubes séparés. Réhydrater l'échantillon de tissu et se préparer pour génotypageping.

2. Coloration Lysotracker de différencier les cultures ES

1. Préparer corps embryoïdes via le ¹⁵ Méthode goutte pendante avec une densité de départ de 500 cellules par baisse de 20 ul.
2. Après 3 jours, le transfert des corps embryoïdes à la culture en suspension sur des boîtes de 10 cm de Petri non-adhérentes (c'est à dire ceux qui sont utilisés pour les travaux bactériologiques). Culture pendant 5 jours, l'évolution des médias tous les 2 jours.
3. Au jour 7, transférer les corps embryoïdes à gélatinisés diapositives de chambre de 8 puits (ajouter 0,1% de gélatine dans les chambres, attendre 5 min, supprimer et ajouter des médias). Transfert des corps embryoïdes 1-2 par chambre.
4. Culture pendant 10 jours, l'évolution des médias tous les jours. Faire attention à placer la pipette à l'angle de la chambre de coulissement de manière à ne pas perturber le corps embryoïdes attachés à la surface du verre. Aussi lors de l'ajout de nouveaux médias également placer la pipette dans le coin de la chambre et de libérer les médias lentement.
5. Après 10 jours de culteure, pour induire l'apoptose comme témoin positif, traiter une partie du puits avec 0,1 mM et 1,0 mM de H ₂ O ₂ (ajouter le H ₂ O ₂ à frais médias, mélanger, puis ajouter les cellules) pendant 60 min. Rincer deux fois avec du D-PBS et culture d'une nuit dans les médias habituels.
6. Aspirer les médias existants et ajouter une solution de coloration Lysotracker cellulaire (500 Lysotracker nM (concentration finale) dans les médias, 300 ul par chambre).
7. Incuber à 37 ° C pendant 15 min.
8. Rincer deux fois avec D-PBS, 2 fois 5 min chacun.
9. Fixer dans du paraformaldéhyde 4% pendant 15 min à température ambiante.
10. Rincer deux fois avec du D-PBS, à 5 min.

3. Voir embryons Stained Lysotracker ou cultures ES

1. Préparer les échantillons cellulaires pour la microscopie par l'aspiration du D-PBS, enlever la chambre de la lame; séchage à l'air pendant environ 5 minutes, et puis en ajoutant un milieu de montage aqueux (Vectashield au DAPI ou similaire). Placez une feuille barrière tout en drying pour diminuer le blanchiment du fluorophore. Montez embryons dans un plat creux en verre-dépression ou petite boîte de Pétri en Vectashield ou similaire.
2. Visualiser avec un microscope à dissection ou composé équipé d'un rhodamine ou Texas Red filtre (Lysotracker ROUGE MDN-99, d'excitation / émission: 577/590 nm). La coloration est généralement assez vif pour les expositions longues sont généralement pas nécessaires.

4. Quantification des résultats des techniques d'imagerie

1. Prenez des photos numériques de vos échantillons dans les mêmes conditions d'exposition en mode manuel.
2. Ouvrez les images dans Adobe Photoshop ou un programme d'imagerie semblable. Pour déterminer le montant de la coloration Lysotracker, sélectionnez le canal rouge et le seuil de l'image (convertit l'image en noir et blanc) de telle sorte que la coloration rouge est maintenant représenté par des pixels blancs. Sélectionnez les pixels blancs et utiliser la fonction histogramme pour obtenir le nombre total.
3. Utilisez le canal bleu de compterle nombre de noyaux dans le domaine. Il peut être utile de garder une trace du comte en annotant l'image.
4. Enregistrer les valeurs et ensuite calculer le niveau de coloration moyenne par cellule. Répétez cette analyse avec le réglage du seuil de même pour toutes les images que vous souhaitez déguster.

5. Les résultats représentatifs

Il est un modèle normal de la CPD au cours du développement embryonnaire qui peut changer quand un gène de facteur de croissance, tels que Sonic hedgehog (Shh), est enlevé ^16,17. Depuis Lysotracker est un colorant petite molécule qui est hautement diffusible, l'embryon entier peut être visualisé à évaluer les zones de la CPD, même au plus profond de l'mésenchyme ^12,13 La figure 1 montre le schéma de coloration pour Lysotracker normales et Shh ^{-. / -} Embryons de souris mutantes à 10.5dpc. A ce stade, la CPD est fortement augmentée dans Shh ^{- / -} embryons mutants, en particulier dans la branche et somite regions. Certaines parties de l'embryon peuvent être visualisées dans l'ensemble de montage à un grossissement supérieur (1B) afin d'évaluer la tendance générale. Parties découpées peuvent également être sectionné avec un microtome vibrant (1C) ou un cryostat (DF) pour révéler les régions PCD plus en détail.

Analyse TUNEL est mieux fait sur des coupes minces où la pénétration de la transférase terminale est moins problématique. Lysotracker coloration et un essai TUNEL peut être fait dans le même tissu (figure 1D-G). Ces résultats montrent que bien qu'il n'y ait pas une stricte corrélation entre 01h01 et Lysotracker coloration TUNEL, les grandes régions de chevauchement PCD considérablement. A plus fort grossissement, il est possible de voir que puncta tache positif avec le test TUNEL mais pas avec le colorant Lysotracker, puncta qui ne tache avec le colorant Lysotracker, et qui se chevauchent puncta coloration.

Quand un EB est plaqué sur une surface revêtues de gélatine, de différenciation des cellules sera Migrate vers l'extérieur. Après 10 jours de culture, les cellules se sont différenciées en une variété de types de cellules, y compris les neurones, les cellules musculaires, et les cardiomyocytes. Les cultures de la figure 2 contiennent des populations mixtes de ces types cellulaires, mais on pourrait adapter notre protocole d'étudier la CPD d'un type cellulaire d'intérêt particulier. Par exemple, la CE pourrait être traitée avec de l'acide rétinoïque pour améliorer la différenciation des neurones ^19, puis le dosage Lysotracker pourrait être utilisée pour évaluer la mort neuronale dans des conditions différentes. Dans la culture de cellules souches embryonnaires normaux différenciés, il existe quelques cellules qui subissent la CPD et ceux-ci peuvent être détectées avec Lysotracker et / ou tests TUNEL (figure 2A). PCD peut être induite par un certain nombre de différents agents cytotoxiques tels que le peroxyde d'hydrogène (H ₂ O _2), qui induit des dommages oxydatifs et initie la voie apoptotique ^20,21. A faible dose d'H ₂ O ₂ augmente à la foisLysotracker et coloration TUNEL par rapport à l'absence de traitement, alors que les résultats d'une dose élevée dans le rétrécissement des cellules et Lysotracker répandue et la positivité TUNEL. À l'instar des résultats de l'embryon, il est possible de voir que lacrymaux coloration positive avec le test TUNEL mais pas avec le colorant Lysotracker, puncta cette tache seulement avec le colorant Lysotracker et lacrymaux qui se chevauchent coloration. La suite de l'application d'un agent cytotoxique qui induit apopotosis est comparée à des conditions de privation de sérum qui induisent l'autophagie (figure 2D). Les cellules qui ont subi une période de privation de sérum (1 heure) présentent un modèle différent où Lysotracker et coloration TUNEL ne pas hautement corrélés. Lysotracker coloration est beaucoup augmenté par rapport aux cultures non traitées, mais la positivité TUNEL est à des niveaux normaux.

Utilisant des outils standard disponibles dans Adobe Photoshop, coloration Lysotracker peut être quantifiée avec une méthode simple seuillagequi permet de calculer le niveau de coloration moyenne pour une population de cellules. Figure 3A-B montre comment une image de l'échantillon ressemble pendant le processus de quantification. A partir d'une image de base avec une coloration Lysotracker dans le canal rouge et les noyaux au DAPI teinté dans le canal bleu (panneau 3A), le canal rouge de cette image est seuillée pour convertir l'image en noir et blanc et les pixels blancs sont ensuite sélectionnés et dénombrés (figure 3A). Un niveau seuil a été choisi qui représente le schéma de coloration Lysotracker. Comme pour toute méthode de quantification qui utilise des images, il est important d'éviter de surexposer vos photos car cela pourrait potentiellement conduire à trop insister sur les différences. Le nombre des noyaux dans le domaine peut alors être pris en compte par regarder juste le canal bleu (figure 3B) et le marquage des noyaux en utilisant un outil de dessin comme un pinceau tout en comptant (figure 3B). On peut alors exprimer èmee niveau de la coloration par le calcul du niveau moyen de la coloration par cellule (nombre de pixels / Nombre de noyaux). Si l'on veut utiliser cet algorithme pour grande par-put dépistage, la plupart des logiciels de dépistage peut mesurer la luminosité dans un canal particulier et ont aussi une fonction d'identificateur d'objet qui comptera noyaux dans un champ, mais pour les applications les plus typiques de la méthode manuelle est rapide et simple. Pour donner un exemple, une zone d'échantillon à partir des figures 2A-C a été mesurée et les résultats confirment que l'augmentation des concentrations de H ₂ O ₂ résultats dans un plus haut niveau de la coloration Lysotracker (figure 3C).

Figure 1. Coloration Lysotracker dans des conditions normales et Shh ^- embryons ^{- /.} A, A 'normaux et Shh ^{-. / -} Embryons de souris à 10,5 dpc, colorées avec Lysotracker rouge, monté dans Vectashield et photographié sousépifluorescente un microscope à dissection. Entre parenthèses indiquent l'emplacement des pattes avant B, B 'patte avant de la normale et Shh ^{-.. / -} Embryons imagée à plus fort grossissement. Notez les domaines normales de la mort cellulaire, y compris la «zone nécrotique postérieur" (marquées d'un astérisque) et une région dans le mésenchyme proximal du bourgeon de membre (indiqué par une flèche). Membres null Shh présentent une coloration plus forte dans la partie médiane et distale . C, C '. sections médiane à travers le bourgeon du membre antérieur de bourgeons de membres à la fois normales et nul. A noter la présence de la coloration dans le mésenchyme proximal (flèche) et l'ARE (tête de flèche) du bourgeon du membre normal et la forte coloration dans le mésenchyme dorsal et ventral et distal dans le bourgeon de membre nulle. DF. La même section (12 microns, congelés section) a été imagé pour Lysotracker et coloration TUNEL (Roche 1684795). L'article passe à travers la partie distale de la mesenc Shh nullHyme. La flèche pointe vers l'ARE. Notez comment la tendance générale est très similaire en utilisant les deux méthodes, mais la coloration ne se chevauchent pas complètement. G, G '. A un plus fort grossissement de l'ARE et le mésenchyme, on peut voir à la fois la présence de points lacrymaux qui sont Lysotracker ou TUNEL-positives seulement ainsi que puncta qui se chevauchent coloration.

Figure 2. Lysotracker coloration dans des cellules ES différenciées. Différenciation des cellules ont été étalées sur lames 8-chambre, en l'absence de LIF. Pour montrer comment Lysotracker et coloration TUNEL comparer, la voie de l'apoptose a été induite avec 2 doses différentes de H ₂ O _2, alors que la voie autophagie a été induite en utilisant 1 heure de privation de sérum. Ces images ont été prises avec un Zeiss LSM5 Microscope confocal A-A'':. Cultures non traitées montrent une apoptose normale, comme indiqué par LysoTracker et coloration TUNEL. Le modèle en utilisant les deux techniques pour la plupart des chevauchements (flèches blanches), cependant, on peut voir un lacrymaux-uns qui sont Lysotracker positives seulement (flèches rouges) B-B'', CC ":. Traitement avec des quantités croissantes de H ₂ O ₂ stimule l'apoptose . La plus faible dose montre plus Lysotracker et TUNEL lacrymaux positive par rapport aux cellules non traitées. La plus forte dose induit dans Lysotracker encore plus et TUNEL positif lacrymaux. Blanc flèches pointent vers coloration qui se chevauchent, tandis que les flèches rouges pointent vers lacrymaux qui sont positifs pour Lysotracker seulement. Il est également possible de voir lacrymaux qui ne sont que positif pour la coloration TUNEL (flèches vertes) DD ":. privation de sérum peut induire l'autophagie, qui peut stimuler une accumulation de matière dans les lysosomes et autophagolysosomes. Notez combien de points lacrymaux Lysotracker plus sont visibles par rapport aux cultures non traitées. TUNEL positif lacrymaux sont présents (dont la plupart se chevauchent Lysotracker tachement, les flèches blanches), cependant, le nombre n'est pas beaucoup augmenté par rapport aux conditions non traités. En outre, dans des conditions de privation de sérum, Lysotracker seule lacrymaux positifs sont très répandues (flèches rouges).

Figure 3. Méthode de quantification pour évaluer le niveau de coloration dans une population de cellules à l'aide d'Adobe Photoshop. R: Une partie de la figure 2A a été choisi et le Lysotracker (rouge) et coloration au DAPI (noyaux, bleu) est montré dans ce groupe A ':. Le canal rouge de la figure 3A a été seuillée pour le convertir en un noir et blanc sur l'image. Les pixels blancs peuvent alors être sélectionnées et comptées en utilisant la fonction histogramme B-B ':. Le canal bleu montre les noyaux et tout en les comptant, l'image peut être annoté avec une fonction de dessin comme un pinceau C:. C'est un exquantification d'un échantillon suffisant de panneaux 2A-C. Les données sont représentées sous forme de pixels par noyaux. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

Caractéristiques importantes de l'apoptose comprennent la détection de lésions de l'ADN avec le test TUNEL, ainsi que la détection de l'activité des caspases (détectée par anticorps monoclonaux ou une molécule de liaison tels que ZVAD-fmk), l'observation des changements cellulaires, et la présentation de la phosphatidylsérine (PS ) sur la surface de la membrane (détecté par l'annexine V liaison). Il ya quelques inconvénients à chacune de ces épreuves. Par exemple, le terminal transférase utilisé dans...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise		Numéro de catalogue
Lysotracker Rouge MDN-99	Invitrogen	# L-7528
BSS Hanks	Invitrogen	14025-076
Paraformaldéhyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTEUR	H-1200
DMEM	Cellgro	10 à 013 CV-
Non-acides aminés essentiels	Cellgro	25-025-CI
Pyruvate de sodium	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-mercaptoéthanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II diapositives Chambre (8 puits)	Nalge Nunc International	154534
0,1% de gélatine	Millipore	ES-006-B
PBS de Dulbecco (D-PBS)	Cellgro	21-031 CV-
			Recettes solution Paraformaldéhyde 4% Pour 100 ml: Mélanger 4 g de paraformaldéhyde, 90 ml de H 2 O, et NaOH (une goutte de NaOH 2N). Le paraformaldéhyde ne vais pas entrer dans la solution jusqu'à ce que vous avez ajouté un peu de NaOH pour augmenter le pH. Mélanger et chauffer à 60 ° C jusqu'à ce que toute la poudre est en solution (~ 10-20 min). Ne pas surchauffer. Ajouter 10 ml ~ 10x PBS pour obtenir un volume final de 100 ml. Conserver à -20 ° C en pratique (~ 10 ml ou 40 ml) ~ aliquotes. AVERTISSEMENT: Le paraformaldéhyde dans «jabot» forme (comprimé petites pastilles) est moins poudré et peut donc être mesurée à l'extérieur d'une hotte. Cependant, vous devez toujours porter un masque anti-poussière (N95au moins) pendant la manipulation. EB Culture, des Médias Pour 500 ml EB médias: DMEM: 404,5 ml FBS: 75,0 ml L-Glutamine: 5,0 ml Pénicilline / Streptomycine: 5,0 ml Non-acides aminés essentiels: 5,0 ml Pyruvate de sodium: 5,0 ml β-mercaptoéthanol: 500ul