Procédé de visualisation et de quantification de la structure tridimensionnelle de 3-veine porte hépatique de la souris ou du conduit biliaire intrahépatique est décrit. Cette technique coulée de résine peut également être appliquée à d'autres systèmes canalaires ou vasculaire et permet In situ La visualisation ou la quantification d'un système intact de l'architecture de communication.
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Article de méthode
Résine de coulée 3-Dimensional Imaging et de la veine porte ou de la souris Système biliaires intrahépatiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
D'organes, l'architecture correcte des structures vasculaires et du carcinome canalaire est indispensable pour la fonction physiologique adéquate, et la formation et le maintien de ces structures est un processus hautement régulé. L'analyse de ces complexes, 3-dimensions des structures a fortement dépendu de chaque examen en 2 dimensions dans la section ou sur des études d'injection de colorant. Ces techniques, cependant, ne sont pas en mesure de fournir une représentation complète et quantifiable des structures canalaires ou vasculaire qu'ils sont destinés à élucider. Alternativement, la nature de la 3-dimensions des moulages en résine plastique génère un instantané permanente du système et est un roman et technique largement utile pour visualiser et quantifier les 3-dimensions des structures et des réseaux.
Un des principaux avantages du système de moulage en résine est la capacité de déterminer l'état intact et connecté, ou la communication, la structure d'un vaisseau sanguin ou un conduit. La structure du duc vasculaire ettal réseaux sont essentiels pour la fonction des organes, et cette technique a le potentiel d'aider étude des réseaux vasculaires et canalaires de plusieurs façons. Coulée de résine peut être utilisée pour analyser la morphologie normale et l'architecture fonctionnelle d'une structure luminale, d'identifier les changements morphogénétiques de développement, et de découvrir les différences morphologiques dans l'architecture des tissus entre l'état normal et la maladie. Des travaux antérieurs ont utilisé une résine de coulée pour étudier, par exemple, des défauts architecturaux et fonctionnels au sein du système biliaire souris intrahépatiques qui n'étaient pas reflétés dans les 2-dimensionnelle analyse de la structure de 1,2, les modifications dans le système vasculaire du cerveau d'un modèle de la maladie d'Alzheimer souris 3 , les anomalies de la veine porte en portail souris hypertendues et cirrhotiques 4, les étapes de développement de la maturation lymphatique rat entre les poumons immatures et adultes 5, immédiats des changements microvasculaires dans le foie de rat, du pancréas et du rein en réponse à une blessure chimique6.
Nous présentons ici une méthode pour générer une résine coulée 3-dimensionnelle d'un réseau vasculaire de la souris ou canalaire, en se concentrant spécifiquement sur la veine porte et voie biliaire intra-hépatique. Ces plâtres peuvent être visualisées par compensation ou macération du tissu et peuvent ensuite être analysées. Cette technique peut être appliquée à pratiquement n'importe quel système vasculaire ou canalaire et serait directement applicable à toute étude enquête sur le développement, la fonction, l'entretien, ou d'une blessure d'une structure en 3 dimensions canalaire ou vasculaire.
Protocole
1. Préparer canule
- Chauffer une section de 1 pouce de long tube de PE10 avec vos doigts et étirez sorte que le tube devient mince.
Remarque: la taille de la cuve ou conduit à une canule permettra de déterminer le degré d'étirement nécessaire. La canule doit être bien tendue pour les voies biliaires jette mais ne peut être exigé d'être modérément étirée pour s'adapter à l'intérieur de la veine grande porte. - Couper le tube étiré en diagonale pour générer un embout biseauté.
- Couper l'autre bord de la tubulure pour créer un segment de 5-6 cm.
- Insérer une jauge de 32, l'aiguille hypodermique ½ pouce dans le bord non biseautée du tube.
2. Préparer la seringue avec du PBS
- Remplissez une seringue de 3 ml avec du PBS.
- Vissez la seringue sur l'aiguille hypodermique avec joint tiré PE10 tube préalablement préparé.
- Seringue Flick et piston de la seringue poussée pour s'assurer que PBS a rempli l'aiguille et tubulure etil n'ya pas de bulles d'air dans la seringue.
- Placez la seringue préparée avec du PBS dans une seringue porte-forme de pâte à modeler. Ce support maintenir constante la seringue pendant que le tube est inséré dans le conduit.
3. Autre Set-up
- Peser 0,1 g de catalyseur dans un petit récipient, par exemple, un puits d'une plaque de 24 puits.
- Pull 1 ml de résine dans une seringue de 3 ml.
Note: les quantités relatives de catalyseur et de la résine peut être ajustée pour modifier le temps de durcissement. Diminuer la quantité de catalyseur peut, toutefois, augmenter les jeter retrait et conduire à une distribution moins souhaitable.
Remarque: lors de la manipulation de résine, prendre des précautions pour éviter tout contact avec de la résine ou l'inhalation des vapeurs de résine. Toujours porter des gants et suivez les étapes impliquant la résine dans un endroit bien aéré, comme une hotte - Coupez un morceau sur 5.0 suture de soie d'environ 5 pouces pour être utilisé comme une ligature.
4. Préparer souris
- Sacrifiez la souris adulte. Posez la souris sur son dos et ouvrir la cavité abdominale.
- Posez la souris sur la plate-forme de dissection étendue. Placez un tube conique de 15 ml perpendiculairement dessous de la souris pour augmenter la visibilité et l'accessibilité au foie.
- Mouillez un coton-tige avec du PBS et l'utiliser pour faire basculer le foie vers le haut et loin de vous exposer le point de vue dorsale du foie avec la veine porte extrahépatique ou canal cholédoque.
- Pour moulages veine porte, vous pouvez empêcher la coagulation du sang par la veine de rinçage à température ambiante PBS. Fixer une aiguille pour une seringue de 3 ml remplie avec du PBS et insérer l'aiguille dans la veine porte extrahépatique dans la mesure du foie que vous le pouvez. Poussez doucement PBS à travers la veine porte. Faire une entaille dans la veine cardinale commune à drainer le sang. Utilisez un coton-tige humide pour le foie massage, améliorer le drainage du sang. Cette étape n'est pas recommandé pour les voies biliaires et peut-être pas nécessaire pour tous les systèmes vasculaires.
Remarque: cette étape peut également être performé avec du paraformaldéhyde 4% au lieu de PBS. L'utilisation de paraformaldéhyde à 4% peut augmenter l'intégrité vasculaire et entraîner une fonte plus précis, en particulier des plus petites structures vasculaires.
5. Cathétériser la veine porte extrahépatique ou voie biliaire principale
- Utiliser une pince courbe pour passer le fil de suture chirurgical sous ligature de la veine porte ou du canal biliaire, d'environ un quart de pouce à partir du foie.
- Attacher le fil de suture dans un noeud lâche commun. NE PAS serrer le nœud.
- Si vous travaillez avec un système ouvert, il peut être utile de lier et serrer une ligature à l'autre bout du système. Si vous avez ouvert la veine cardinale commune pour drainer le sang de la veine porte, attachez une ligature autour d'elle pour augmenter la pression dans la veine porte et empêcher la fuite de résine dans la veine hépatique central.
- Utilisez des ciseaux à ressort pour faire une petite incision dans la veine porte ou du canal biliaire, environ ¼ de pouce au-dessous du nœud de suture. Ce cut doit pénétrer pas plus de la moitié du diamètre de la veine porte ou biliaire.
- En utilisant une pince n ° 5, maintenez la veine porte ou canal cholédoque sur le site de la coupe et insérer l'extrémité biseautée du tube dans le canal cholédoque.
- Poussez la pointe du tube après la ligature pré-noué et vers le foie.
- Test de précision par injection de PBS canulation travers la canule et regarder pour voir si elle pénètre dans la veine porte ou des voies biliaires.
- Serrer la ligature pour maintenir la canule en place.
6. Résine de coulée de la veine porte ou voie biliaire intrahépatique
- Ajouter pré-mesurée de résine 1 ml de pré-mesurée 0,1 g de catalyseur et mélanger soigneusement. Éviter de générer des bulles d'air.
- Dessinez résine-catalyseur mélange dans la seringue de 3 ml. Retirer les bulles d'air par un léger effleurant la seringue et l'expulsion de bulles.
Remarque: pour la coulée de petites structures, il peut être utile d'utiliser une chambre à vide pour éliminer les bulles d'air de très petits èmee de résine et d'améliorer la qualité coulé. Pour permettre le temps d'effectuer cette étape, il sera nécessaire de diminuer le ratio catalyseur / résine de celle suggérée ci-dessus afin de ralentir durcissement de la résine. - Soigneusement remplacer PBS contenant seringue avec une seringue contenant une résine, en laissant l'aiguille de calibre 32 fixée à la canule.
- Poussez lentement et doucement la résine dans la veine porte ou de la voie biliaire jusqu'à ce que la résistance augmente et le foie est rempli.
- Utilisez un coton-tige humide pour masser doucement le foie et favoriser un même remplissage.
- Retirer la canule de la structure et rapidement re-serrer la ligature pour éviter les fuites de résine.
- Laissez la souris à plat à température ambiante pendant 20 minutes tout en la résine durcit, puis retirez le foie.
- Soit procéder à la compensation ou de la macération du foie.
7. Foie clair pour la visualisation in situ
- Fixer le foie dans du paraformaldéhyde 4% pendant une nuit à 4 ° C, à bascule.
- Laver le foiedans du PBS pendant au moins quatre heures, à bascule. À ce stade, vous pouvez séparer les lobes du foie si vous le souhaitez.
- Déshydrater dans du methanol à 50%, puis dans le méthanol à 100% pendant au moins quatre heures chacune, se balançant à la température ambiante.
- Effacer le foie dans une solution 1:2 de l'alcool benzylique et le benzoate de benzyle (BABB) pendant au moins 24 h, à bascule. Fois plus de temps de lavage peut être nécessaire. Si le foie ne disparaît pas complètement au bout de 2-3 jours, revenir à 100% de méthanol pendant 24 heures et répétez BABB compensation.
- Foie plonger dans BABB dans un plat en verre de Pétri pour l'imagerie in situ.
8. Faire macérer les tissus du foie
- Retirer le foie de la souris et placé dans un tube conique de 50 ml avec de l'eau. Attendre 1 heure pour le durcissement de résine complet. Lobes du foie séparés si désiré.
- Verser l'eau et se déplacer foie pour une bouteille en verre. Plonger dans 15% de KOH. Laissez sécher une nuit à température ambiante. Ne pas basculer.
- Versez délicatement hors de KOH et laver coulé dans de l'eau distillée. Remarque: le casting est very fragiles et doivent être manipulés avec précaution. Ne pas perturber la coulée lors de l'ajout ou le retrait de fluide à partir du tube.
- Lorsque moulé en résine est propre, poser délicatement sur une Kimwipe à sécher, puis transférer dans un conteneur pour être stocké.
9. Les résultats représentatifs
Une distribution réussie de la veine porte ou voie biliaire affiche un réseau continu de plus en plus petites branches s'étendant à partir de l'hile à la périphérie du foie.
La figure 1 montre une veine porte moulé comme visualisées in situ après BABB compensation. La figure 1A montre la distribution de la totalité lobe gauche du foie et de la forme et de la taille de la fonte. Figure 1B montre une vue rapprochée de la même coulée, ce qui démontre la pénétration de la résine dans les plus petites branches de la veine porte du foie périphérie.
La figure 2 montre une distribution veine porte qui a subi KOH mamilieu carcéral. Figure 2A montre le lobe hépatique gauche entier et la figure 2B est un gros plan sur les petites branches périphériques.
Cette technique a également été appliquée avec succès à la voie biliaire intrahépatique et publiés en utilisant à la fois la compensation BABB et les techniques de macération KOH 1,2,7.
Les problèmes courants incluent incomplète remplit, des bulles dans la résine, et déborder dans les systèmes environnants ou des tissus. Figure 3 montre comment reconnaître un remplissage incomplet (figure 3A), des bulles (figure 3A), et un trop-plein de résine de la veine porte à l' veine centrale (figure 3B).
Toutes les images sont prises en utilisant un Leica MZ 16 stéréoscope FA et QImaging Retiga 4000R caméra.
Figure 1. Coulée de résine BABB-débarrassée de gauche veine porte hépatique du lobe. Moulé en résine A. montre une structure hiérarchique de branchement s'étendant du hile à la périphérie du foie. Coulée de résine apparaît en jaune dans les lobes du foie bleutée. B. Une illustration montre que la résine de remplissage s'étend à de petites branches dans la périphérie du foie. La résine est blanchâtre à travers le foie effacé. Barre d'échelle = 1 mm.
Figure 2. Tissue-macérés résine coulée d'insuffisance hépatique veine porte gauche lobe. Résine A. jeté du lobe du foie entier montre de nombreuses branches de différentes tailles. B. Gros plan montre les petites branches en périphérie du foie. Adoucir l'aspect de petites branches représente résine de remplissage des espaces sinusoïdaux et peut ou peut ne pas être visible sur résine jette et augmenter la densité apparente branche si elle est présente. Résine est de couleur blanche. Barre d'échelle = 1 mm.
Figure 3. Problèmes courants avec des moulages en résine. A. Un remplissage incomplet de la veine porte lobe gauche est évident par tout ou partie des branches moulées à défaut d'étendre à la périphérie du foie. Cette fonte affiche également bulles, visible comme des ruptures dans la coulée continue (flèche). En raison de la proximité de la veine porte et la veine centrale de branches dans certains endroits B., la résine veine porte souvent entrer et remplir la veine centrale. Cela peut être reconnu quand il ya deux hilaires branches distinctes (flèches) et deux structures ramifiées qui ont des motifs différents et se chevauchent. Discrimination entre les erreurs techniques et les véritables altérations morphologiques qui peut être fait de deux manières. Tout d'abord, la structure de coulée doit être comparé à la structure attendue sur la base de 2-dimensionnelle d'analyse ou d'autres méthodes. Deuxièmement, il est important d'effectuer plusieurs répétitions, et, si possible, de quantifier la structureure et effectuer une analyse statistique pour déterminer la reproductibilité et s'il ya une altération significative morphologique entre et au sein des différents expérimentale et des bras de commande.
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Discussion
Nous avons décrit des exemples précis de la façon dont la veine porte et systèmes des voies biliaires intra-hépatiques du foie peut être lancé, mais cette technique peut être appliquée à n'importe quel autre système canalaire ou vasculaire avec de légères adaptations. Des travaux antérieurs ont démontré la faisabilité de cette technique dans de multiples espèces, y compris la souris 1,2,7-9, caneton, lapin 10,11 12,13, chien 14, 15, et le cochon et dans de nombreux organes, y compris...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health (NIH) à SSH (R01-DK078640), du Howard Hughes Medical Institute (HHMI) à travers le Programme HHMI / Vanderbilt Certificat universitaire en médecine moléculaire à TJW (GRDOT56006779), le Vanderbilt recherche sur le diabète et Training Center (P30-DK020593) et la Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30-DK058404) la fourniture des services de base.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| PE10 tuyaux en polyéthylène | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 chirurgicale soie noire tressée | Roboz chirurgicale | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x aiguille de 13 mm | Air-tite | TSK3213 | |
| Ciseaux à ressort | Outils Fine Science | 15000-08 | |
| Numéro 5 forceps | Outils Fine Science | 91150-20 | |
| MercOx II Kit | Ladd recherche | 21247 | |
| Alcool benzylique | Fisher Scientific | 1816-1804 | Oeul nécessaire pour BABB-compensation |
| Le benzoate de benzyle | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Uniquement nécessaire pour BABB-compensation |
| Tampon phosphate salin (PBS) | |||
| Pâte à modeler | |||
| Échelle | |||
| Ciseaux de laboratoire | |||
| Tubes de 15 ml en polypropylène capitalisation | |||
| Paraformaldahyde 4% | |||
| 15% d'hydroxyde de potassium (KOH) | Uniquement nécessaire pour la macération | ||
| Lame de rasoir | |||
| Méthanol à 100% | |||
| 3 ml seringue luer lock |
Références
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Réimpressions et autorisations
