ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

Summary

Ce protocole présente une procédure complète et détaillée à appliquer ARN-seq, une puissante technologie de l'ADN de la prochaine génération de séquençage, de transcriptomes profil de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est généralisable à différentes cellules ou des tissus affectés par différents réactifs ou états pathologiques.

Abstract

La caractérisation de l'expression des gènes dans les cellules via la mesure des niveaux d'ARNm est un outil utile pour déterminer comment la machinerie transcriptionnelle de la cellule est affectée par des signaux externes (traitement médicamenteux, par exemple), ou comment les cellules diffèrent entre un état ​​sain et un état ​​pathologique. Avec l'avènement et le raffinement continu de la technologie de l'ADN de la prochaine génération de séquençage, séquençage de l'ARN (ARN-seq) est devenue une méthode de plus en plus populaire de l'analyse du transcriptome de cataloguer toutes les espèces de transcriptions, de déterminer la structure de la transcription de tous les gènes exprimés et à quantifier les niveaux d'expression de l'évolution de l'ensemble total de transcrits dans une cellule donnée ^1,2, tissu ou organisme. ARN-seq remplace progressivement les puces à ADN comme une méthode pratique pour l'analyse du transcriptome, car il a les avantages de profilage d'un transcriptome complet, offrant une donnée de type numérique (nombre de copies de la transcription) et ne comptez sur aucune séquentielle génomique connueCe ^3.

Ici, nous présentons un protocole complète et détaillée à appliquer ARN-seq pour transcriptomes profil de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est basé sur notre étude publiée récemment intitulé «RNA-seq révèle transcriptome Novel des gènes et de leurs isoformes de l'homme dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traités par la thrombine," ^4, dans lequel nous avons réussi a effectué la première analyse complète du transcriptome de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traité avec de la thrombine en utilisant l'ARN-seq. Elle a abouti à des ressources sans précédent pour de nouvelles expérimentations afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la thrombine dysfonction endothéliale dans la pathogénie des maladies inflammatoires, le cancer, le diabète et les maladies coronariennes, et fournit de nouvelles pistes potentielles pour cibles thérapeutiques pour ces maladies.

Le texte descriptif de ce protocoleest divisé en quatre parties. La première partie décrit le traitement de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec la thrombine et d'isolement d'ARN, analyse de la qualité et de quantification. La deuxième partie décrit la construction de bibliothèques et de séquençage. La troisième partie décrit l'analyse des données. La quatrième partie décrit un essai de validation par RT-PCR. Les résultats représentatifs de plusieurs étapes clés sont affichés. Conseils utiles ou les précautions à stimuler le succès dans les étapes clés sont fournis dans la section Discussion. Bien que ce protocole utilise de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traitées avec de la thrombine, elle peut être généralisée à transcriptomes de profil dans les deux cellules de mammifères et non mammifères et dans les tissus traités avec différents stimuli ou des inhibiteurs, ou pour comparer les transcriptomes dans des cellules ou des tissus entre un état de santé et un état de maladie.

Protocol

Un organigramme décrivant ce protocole est affiché à la figure 1.

1. Le traitement des cellules avec de la thrombine, RNA, évaluation de la qualité et la quantification de l'ARN

1. Culture cellules humaines endothéliales microvasculaires pulmonaires (HMVEC-LBL) à 90-100% de confluence dans des plaques 6 puits en milieu EGM-2 avec 5% de FBS, des facteurs de croissance et des antibiotiques (Lonza, chat # CC-3202).
2. Changer médias pour les médias famine (0% de FBS) 30 min avant le traitement avec de la thrombine.
3. Traiter les cellules avec 0,05 U / ml de thrombine ou de quitter traitée comme ....

Results

Pour l'étape 1: L'28s: 18s rapport est traditionnellement utilisé comme un indicateur de la dégradation de l'ARN. Idéalement, le pic 28s devrait avoir environ deux fois la surface de la bande 18 (un ratio de 2), mais cette proportion idéale n'est pas souvent vu dans la pratique. En outre, 28s: 18s ratios obtenus à partir de méthodes spectrophotométriques peut sous-estimer l'importance de la dégradation de l'ARN. Pour plus de précision quantifier la dégradation, et donc la qualité de l'échantillon d'ARN,.......

Discussion

Les étapes clés

Manipulation d'ARN: RNases se dégrade, même les plus de haute qualité d'ARN, donc il faut faire attention lors de l'isolement, le stockage et l'utilisation de l'ARN ^10. Les gants sont toujours portés afin de prévenir la contamination par des RNases trouvés sur les mains de l'homme. Les gants doivent être changés souvent, surtout après la peau toucher, les poignées de porte ou d'autres surfaces communes. Un ensemble de pipet.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactifs ou équipements	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules humaines endothéliales microvasculaires pulmonaires	Lonza	CC-2815
Lonza, Kit Bullet	Lonza	CC-3202	Contient EGM-2, FBS, des facteurs de croissance et des antibiotiques
La thrombine	Sigma	T4393
Ambion mir Vana Kit	Life Technologies	AM 1560
RNase-Zap	Life Technologies	AM9782
Experion StdSens ARN	Bio-Rad	700-7103
Préparation d'ARN TruSeqTrousse	Illumina	FC-122-1001
Perles AMPureXP	Beckman Coulter	A63881
Superscript II de la transcriptase inverse	Life Technologies	18064-014
Experion ADN 1K	Bio-Rad	700-7107
QuantiTect Sybergreen	Qiagen	204163
PE Cluster Génération Kit	Illumina	PE-401-3001
PhiX Kit de contrôle	Illumina	FC110-301
200 Cycle SBS Kit	Illumina	FC-401-3001
HiScanSQ *	Illumina	SY-103-2001
CBOT	Illumina	SY-301-2002
machine à qPCR - Viia7	Life Technologies	Modèle # VIIA7 / Equipement # 10631261	Ou équivalent
Système Experion	Bio Rad	7007001	Bioanalyzer est un système alternatif
Spectrophotomètre	Bio-Tek	Spectrophotomètre pour microplaques Epoch	Ou équivalent
Centrifugeuse - Sorvall Legend XTR	Thermo Scientific	75004521	Ou équivalent
Support magnétique	Life Technologies	AM10027
96-bien thermocycleur	Fournisseur General Lab
			Tableau 3. Liste des réactifs et des clés E Majorquipement. * Dans la vidéo, au lieu de HiSeq1000 HiScanSQ a été démontrée.