Article de méthode

Timing chromosome Réplication Combiné avec fluorescent

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DOI :

10.3791/4400

⸱

10 décembre 2012

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University

Dans cet article

Résumé

Procédé pour l'analyse quantitative de la réplication du chromosome de synchronisation est décrit. La méthode utilise l'incorporation de BrdU en combinaison avec fluorescent In situ Hybridation (FISH) afin d'évaluer le calendrier de réplication des chromosomes de mammifères. Cette technique permet la comparaison directe des chromosomes réarrangés et non réarrangé dans la même cellule.

Résumé

Réplication de l'ADN des mammifères initie à plusieurs endroits le long des chromosomes à différents moments au cours de la phase S, la suite d'un programme de réplication temporelle. La spécification de la synchronisation de réplication est considéré comme un processus dynamique régulée par des signaux spécifiques de tissus et de développement qui répondent aux modifications épigénétiques. Cependant, les mécanismes de régulation où et quand réplication de l'ADN initie le long des chromosomes reste mal comprise. Chromosomes homologues généralement se répliquer de manière synchrone, mais il ya des exceptions notables à cette règle. Par exemple, dans les cellules de mammifères femelles l'un des deux chromosomes X devient une réplication tardive par le biais d'un processus appelé inactivation du chromosome X 1. Avec ce retard dans le calendrier de réplication, estimé à 2-3 h, la majorité des gènes transcriptionnellement silencieux deviennent le seul chromosome X. En outre, un discret agissant en cis lieu, connu comme le centre inactivation du chromosome X, réglemente ce processus inactivation du chromosome X, y compris èmee induction de la réplication temps différé sur le chromosome X inactif entier. En outre, certains réarrangements chromosomiques trouvés dans les cellules cancéreuses et les cellules exposées à des rayonnements ionisants afficher un retard important dans le calendrier de la réplication> 3 heures qui affecte le chromosome entier 2,3. Des travaux récents de notre laboratoire indiquent que la perturbation de discret agissant en cis autosomique résultat loci dans un phénotype extrêmement réplication tardive qui affecte l'ensemble du chromosome 4. Études 'ingénierie chromosomique »supplémentaires indiquent que les réarrangements chromosomiques affectant certains nombre de résultats différents chromosomes anormal dans ce moment-phénotype de réplication, ce qui suggère que tous les chromosomes de mammifères contiennent discrets agissant en cis locus qui contrôlent le calendrier de réplication des chromosomes individuels 5.

Ici, nous présentons une méthode pour l'analyse quantitative de la synchronisation de réplication chromosomique associée à hybridation fluorescente in situ. Cetteméthode permet une comparaison directe de la synchronisation de la réplication entre chromosomes homologues au sein de la même cellule, et a été adapté à partir de 6. En outre, cette méthode permet l'identification sans ambiguïté des réarrangements chromosomiques qui sont en corrélation avec l'évolution du calendrier de réplication qui influent sur le chromosome entier. Cette méthode présente des avantages par rapport élaboré récemment débit micro-array haut ou le séquençage protocoles qui ne peuvent distinguer entre les allèles homologues présents sur réorganisées et non réorganisées-chromosomes. En outre, parce que la méthode décrite ici évalue cellules individuelles, il peut détecter des changements dans le calendrier sur la réplication des chromosomes réarrangements chromosomiques qui sont présents dans seulement une fraction des cellules dans une population.

Protocole

1. L'incorporation de BrdU (repérage des bornes)

  1. Cellules de la plaque à environ 70% de confluence dans une culture de tissu plat 150 mm 24 h avant l'addition de BrdU.
  2. Remplacez le support avec des produits frais milieu complet contenant 20 ug / ml de BrdU (Sigma) à des moments appropriés avant la récolte. La longueur de temps sont les cellules cultivées dans des milieux avec BrdU varient selon le type cellulaire et des espèces, généralement la phase G2 dure entre 2 et 5 heures (figure 1).

2. Récolte chromosomique des cultures monocouches de cellules

  1. Retirer des milieux de culture à partir de la plaque et reçois 10 ml dans un tube de centrifugeuse de 15 ml conique. Jeter les feuilles restantes.
  2. Rincer les cellules une fois avec 10 ml Versine [ou HBSS (Sigma)].
  3. Ajouter 5 ml de trypsine 0,25% dans Versine (ou HBSS) à la plaque. Incuber à la température ambiante jusqu'à ce que les cellules sont détachées de la plaque.
  4. Ajouter suspension de cellules trypsinisées dans le tube contenant 10 ml de médias de l'étape 2.1.
  5. Centrifuger à 400 xg pendant 10 min pour sédimenter les cellules. Aspirer le surnageant en laissant 0,5 ml de milieu ainsi que le culot cellulaire.
  6. Remettre en suspension les cellules à fond par pipetage avec une pipette Pasteur.
  7. Ajouter 3 gouttes de solution hypotonique (0,075 M de KCl (Sigma) chauffé à 37 ° C) et mélanger la suspension cellulaire avec une pipette Pasteur. Ajouter 0,5 ml de solution hypotonique et mélanger à nouveau avec une pipette Pasteur. Amener le volume de solution hypotonique à 5 ml et mélanger de nouveau. Incuber à 37 ° C pendant 20-45 min, en fonction du type cellulaire.
  8. Centrifuger à 400 xg pendant 10 min. Aspirer le surnageant en laissant 0,5 ml de milieu ainsi que le culot cellulaire.
  9. Reprendre le culot cellulaire en effleurant doucement le tube. Les cellules osmotiquement gonflées sera fragile à ce stade, donc il faut prendre soin de ne pas perturber les membranes cytoplasmiques.
  10. Ajouter 3 gouttes de fixateur de Carnoy (acide acétique glacial 01h03: Le méthanol); mélanger doucement par pipetage avec un pipett Pasteure. Ajouter 0,5 ml de fixateur et mélanger en pipetant doucement avec une pipette Pasteur. Amener le volume de fixateur à 5 ml et mélanger à nouveau en pipetant doucement avec une pipette Pasteur. Les cellules fixées peuvent être stockés dans l'obscurité à -20 ° C pendant plusieurs mois.
  11. Centrifuger et aspirer comme à l'étape 2.8.
  12. Remettre en suspension le culot cellulaire dans du fixateur frais; estimer le volume de la pastille et ajouter ~ 10x le volume de fixateur de Carnoy.
  13. Ajouter la suspension de cellules goutte à goutte sur des lames de microscope humides, glacées; maintenir la lame à un angle de 45 ° ~ et permettre la suspension de cellules à s'écouler sur la surface de la lame. Posez la lame à plat sur du papier absorbant et les inondations la diapositive avec un fixateur, laisser sécher. Vérifiez diapositives de la présence d'écarts mitotiques en utilisant un microscope inversé.

3. Traitement RNase et déshydratation de l'éthanol

  1. Lieu 200 ul de 10 pg / ml de RNase A (Sigma) dans 2x SSC à chaque diapositive; incuber à 37 ans & deg; C pendant 1 heure.
  2. Laver les lames 3 fois avec 2x SSC, pH 7,0 à température ambiante pendant 3 min chacun.
  3. Déshydrater les lames grâce à un mélange EtOH (Sigma) série (70%, 90% et 100%) à la température ambiante pendant 3 min chacun.
  4. Sécher les lames d'air à température ambiante.

4. Préparation de cocktails de sonde pour BAC + chromosomique spécifique énumération centromère Probe (CEP) ou pour les peintures chromosomiques entiers Hybridation in situ

  1. Pour l'hybridation BAC / CEP simultanée, préparer deux cocktails sondes séparées pour les pré-hybridation. Nous avons trouvé que la pré-hybridation des sondes d'alcoolémie et le SCEP séparément dans les résultats stringences différentes en moins d'arrière-plan et les intensités de signaux supérieures. Nous avons également constaté que fosmides individuels peuvent également être utilisés à la place de clones BAC. La formulation cocktail décrit ci-dessous représente les volumes pour une seule diapositive. Si le traitement de plusieurs diapositives en utilisant les mêmes sondes simplement augmenter le volume appropr iately.

    * BAC sonde d'ADN cocktail:

    11,5 ul de tampon d'hybridation (formamide 50% (Sigma) / 2x SSC / Dextran Sulfate (Sigma)) 2 ul dH 2 O

    2,5 pi BAC/Cot1 ADN dans dH 2 O (voir ci-dessous pour l'étiquetage protocole) un volume de 15 ul au total

    * CEP sonde cocktail:

    7 pi de tampon d'hybridation CEP (65% Formamide/2x SSC / Dextran Sulfate) 2 ul dH 2 O

    D'ADN de 1 ul CEP/Cot1 (acheté préalablement marqué avec Spectrum Orange/Cy3/Texas Rouge) 10 ul de volume total de

    * Après dénaturation et de pré-hybridation (étape 5.1) mélange BAC sonde avec le CEP sonde à un 3:2 ratio de 25 cocktails sonde ul / slide et mélanger.

    OU

  2. Aliquote de 20 ul / diapositive de la sonde chromosomique Peinture entier (Cy3/Texas rouge) dans un tube. Passez à la dénaturation et de pré-hybridation étape.
"> 5. Faites glisser et dénaturation de la sonde et hybridation in situ

  1. Dénaturer sonde cocktail (s) à 75 ° C pendant 10 min. Pré-hybridation à 37 ° C pendant 30 min pour permettre l'ADN Cot1 de s'hybrider à des séquences répétitives et d'empêcher l'hybridation subséquente de chromosomes en métaphase.
  2. Diapositives dénaturer dans des jarres de Coplin à 70% Formamide/2x SSC, pH 7,0 à 72 ° C pendant 3 min.
  3. Immédiatement déshydrater diapositives à travers une série EtOH (70%, 90% et 100%) dans des jarres de Coplin à 4 ° C pendant 3 minutes chacun.
  4. Laisser les lames sécher à l'air à température ambiante.
  5. Préchauffer les diapositives à 45 ° C sur la lame chaude pour les 10 dernières minutes de la sonde pré-hybridzation (étape 5.1). Mélanger cocktails sonde pré-hybridés si nécessaire et ajouter 25 ul de chaque diapositive, placez doucement une lamelle sur chaque diapositive et joint le long de tous les bords avec la colle de caoutchouc. Incuber une nuit à 37 ° C dans une chambre humidifiée pour éviter l'évaporation.

6. Hybridation Message Lave

  1. Laver les lames dans des jarres de Coplin 3 fois dans 50% formamide/2x SSC, pH 7,0 à 38-40 ° C pendant 3 minutes chacun. La température des lavages peut varier entre sondes. S'il ya hybridation de fond élevé, vous pouvez augmenter la température des lavages. A l'inverse, si le signal est faible et il n'y a pas d'arrière-plan, vous pouvez diminuer la température de ces lavages.
  2. Laver les lames 1 fois dans du tampon de PN à la température ambiante pendant 3 min, puis passez à l'étape de détection du BrdU.

7. Détection BrdU

  1. Bloc glisse avec un tampon PNM pendant 10 min (200 pi / diapositive) à la température ambiante dans l'obscurité.
  2. Égoutter les lames en les tournant sur chant sur une serviette en papier. Ajouter 100 ul d'anti-BrdU-FITC (50 pg / ml Roche ou Millipore) dans un tampon PNM pendant 30 min à 37 ° C.
  3. Laver les lames 3 fois dans le tampon de PN à température ambiante pendant 3 min chacun.
  4. Drainerexcès de tampon de PN sur diapositives une à la fois en tournant sur chant sur une serviette en papier. Ajouter 20 ul DAPI / antifade montage solution (Invitrogen). Recouvrir la lame avec une serviette en papier et appuyez sur la lamelle pour forcer les bulles d'air et l'excès de solution de montage. Procéder à l'analyse d'image.

8. Capture d'images et de quantifier l'incorporation de BrdU

  1. Les images sont capturées avec un appareil Olympus BX61 microscope à fluorescence et Olympus Caméra CCD, objectif 100x, filtre automatique-roue et logiciels Cytovision (Applied Imaging). BrdU est capturé à l'aide d'un filtre FITC, les peintures chromosomiques (Texas Red, métasystèmes ou Cytocell), BAC (Cy3) et CEP (Vysis Spectrum Orange) sondes sont capturées à l'aide d'un Texas Red ou Cy3 filtre DAPI est capturée avec un filtre DAPI (voir Les figures 2 et 3).
  2. Chromosomes individuels d'intérêt sont identifiés avec le BAC / CEP ou sondes chromosomiques spécifiques de peinture (figures 2B et 3B). Utilisantle logiciel Cytovision, chaque chromosome d'intérêt est "découpé" en métaphase de la propagation dans l'ensemble, une ligne est tracée à travers le long de la longueur du chromosome de bras court à bras long (figures 2C et 3C). Le logiciel Cytovision est utilisé pour quantifier le profil d'intensité de pixel le long de la longueur de chaque chromosome. Le logiciel calcule Cytovision la zone occupée par les pixels et quantifie l'intensité des pixels représentés par les signaux de BrdU ou DAPI de chaque chromosome isolé. L'intensité moyenne des pixels représentés par chaque chromosome est alors multiplié par la surface occupée par les pixels pour obtenir le nombre total de pixels (tableau 1 et figure 4). En outre, ce protocole permet la visualisation des dernières régions réplication des chromosomes. Par conséquent, le motif à bandes d'incorporation de BrdU permet la détection des régions activement réplication des chromosomes, et les différences dans le calendrier de réplication entre les chromosertains paires sont considérées comme des différences dans ce modèle de bandes (figures 2 et 3). Enfin, ces différences dans les modes de liaison peuvent être comparées à des cartes connues de synchronisation de réplication pour chaque chromosome 6,7, ce qui permet une estimation de la différence de temps de réplication entre les chromosomes homologues ou des bras chromosomiques 4. Par exemple, le chromosome 6 les deux sur la figure 3A afficher une différence dans des bandes de motif> 2 heures par rapport à la normale de synchronisation de réplication du chromosome 6 4.
    En outre, une procédure similaire à celle décrite ici a été utilisée avec succès pour l'étude de la chronologie de réplication asynchrone entre les chromosomes X actifs et inactifs 8,9. Les chromosomes X actifs et inactifs ont été identifiés en utilisant des peintures du chromosome X. Les images ont été acquises à l'aide du logiciel Quips mFISH (Vysis) et le nombre de pixels occupés par les chromosomes X et le nombre de pixels occupés par fluorescence labeled BrdU ont ensuite été calculées à l'aide NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).

9. Nick Traduction ADN de BAC pour le marquage fluorescent (Vysis)

  1. Ajouter le mélange refroidi sonde suivante pour un tube de centrifugeuse:
    70 pi (4 pg d'ADN) dans dH 2 O
    10 pl 0.2 mM dUTP-orange ou vert
    20 pl 0.1 mM dTTP
    20 ul de tampon 10x Traduction Nick
    40 ul de dNTP NT (moins dTTP)
    40 ul enzyme Traduction nick
    Volume de 200 ul totale
    Incuber à 16 ° CO / N. Arrêter la réaction par chauffage à 70 ° C pendant 10 min. Refroidir sur glace pendant 5 min.
  2. Précipiter l'ADN avec de l'éthanol en ajoutant ce qui suit au mélange de sonde:
    Solution 200 ul de sonde
    48 ul de NaOAc 3 M
    160 ul Cot1DNA (.25 g / ul)
    1200 EtOH ul 100%
  3. Conserver à -80 ° C pendant 10 min pour O / N.
  4. I Spinn froide à 12.000 xg pendant 20 min. Décanter EtOH. Laver 1 fois avec de l'EtOH 70%. Faites tourner comme avant. Décanter EtOH. Sécher à l'air jusqu'à ce que s'évapore EtOH. Remettre en suspension dans 40 ul dH 2 O pour une concentration finale de 100 ng / pl d'ADN de BAC.

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Résultats

Un exemple de l'analyse de la synchronisation de réplication du chromosome 6 humain est montré dans la figure 2. Des cellules contenant une délétion du gène ASAR6 4, situé à 6q16.1, ont été exposés à BrdU pendant 5 heures, la récolte des cellules mitotiques et traitées de FISH avec une sonde de peinture chromosomique 6 (Vysis) et pour l'incorporation de BrdU. Notez qu'il ya une différence significative dans le modèle de BrdU bandes entre le deux 6, ce qui correspond à un retard da...

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Discussion

La préparation des étalements de chromosomes est une étape cruciale pour la réussite de la réplication de synchronisation essai décrit ici. L'inclusion d'une étape de prétraitement colcémide avant le traitement hypotonique peut aider à la fréquence et la propagation des cellules mitotiques. En général, nous exposer les cellules à colcemdi pendant 1-3 heures avant la récolte, et l'utilisation colcémide à une concentration finale de 10 ug / ml. Toutefois, l'inclusion d'une étape de prétraitement colcém...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Institut national du cancer, CA131967.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue Commentaires (optionnel)
Anti-BrdU-FITC Roche Millipore 11202593001 MAB326F 50 ug / ul
Nick Translation Kit Abbott Molecular (Vysis) 07J00-0001
Spectrum Orange dUTP Abbott Molecular (Vysis) 02N33-050
CEP Abbott Molecular (Vysis) Varie
Tampon d'hybridation INS / PCM Abbott Molecular (Vysis) 06J67-011
Tampon d'hybridation CEP Abbott Molecular (Vysis) 07J36-001
Chromosome paints Métasystèmes Groupe D-14NN-050-TR
Olympus BX61 microscope à fluorescence Olympe BX61TRF-1-5
Système logiciel microscope d'imagerie Applied Imaging Cytovision 3.93.1
Appareil photo numérique Olympe UCMAD3

EN RECETTES hybridation in situ
Solutions Formamide
70% Formamide/2x SSC

35 ml formamide * (Sigma)
10 ml 10x SSC
5 ml d 2 H 2 0
pH à 7,0 avec HCl (Sigma)

* Il est important d'utiliser le formamide qui a été stocké à -20 ° C. Stockage prolongé température ambiante va générer l'acide formique et le pH wmal-être trop bas.

50% Formamide/2x SSC

25 ml de formamide (Sigma)
10 ml 10x SSC
15 ml dH 2 O
pH à 7,0 avec HCl (Sigma)

20x SSC, 4 L

702 g de NaCl (Sigma)
358 g de citrate de sodium (Sigma)
dH 2 O en volume

PN tampon [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)]

Préparer une solution à 0,1 M de phosphate de sodium chacun (Filtre stériliser et stocker en aliquots ml 500).

0,1 M de NaH 2 P0 4, 1 L

13,8 g de NaH 2 P0 4 (Sigma):
dH 2 O en volume

0,1 M de NaH 2 P0 4 1 L

14,2 g de NaH 2 P0 4 (Sigma)
dH 2 O en volume.

PN: Ajuster le pH de 0,1 M Na 2 HP0 4 à pH 8,0 avec 0,1 M NaH 2 P0 4. Stériliser par filtration et ajouter 1 ml de NP-40.

PNM 50 ml

1,25 g Non lait écrémé en poudre (Sigma)
25 ml de tampon PN (recette ci-dessus)

Mélanger pendant 15-20 min en remuant constamment. Faites tourner 2 fois à 400 xg pendant 10 min. Utiliser le surnageant, et assurez-vous de ne pas déranger les protéines du lait précipités.

Références

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  2. Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).
  3. Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
  4. Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
  5. Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
  6. Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
  7. Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
  8. Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. Genetics. 171, 663-672 (2005).
  9. Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. Genetics. 174, 1115-1133 (2006).
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Mots-clés

Chromosome Replication TimingBRDU IncorporationMetaphase Chromosome AnalysisDNA FISH ProtocolCyto Vision SoftwareHomologous Chromosome ComparisonChromosomal Rearrangement DetectionReplication Timing QuantificationSingle Cell Analysis

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