Assistée par matrice transplantation de chondrocytes autologues pour la rénovation et la réparation des vices chondrales dans un modèle de lapin

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4422

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Article de méthode

Assistée par matrice transplantation de chondrocytes autologues pour la rénovation et la réparation des vices chondrales dans un modèle de lapin

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DOI :

10.3791/4422

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21 mai 2013

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Une technique expérimentale pour le traitement de défauts chondraux dans l'articulation du genou du lapin est décrite. L'implantation de chondrocytes autologues ensemencées sur une matrice est une méthode bien acceptée pour la rénovation et la réparation des lésions du cartilage articulaire qui fournissent des résultats satisfaisants à long terme. Assistée par matrice transplantation de chondrocytes autologues (MACT) propose une méthode d'implantation standardisée et cliniquement établie.

Résumé

défauts du cartilage articulaire sont considérés comme un problème de santé majeur, car le cartilage articulaire a une capacité limitée pour l'auto-régénération ^1. Lésions du cartilage non traitées mènent à la douleur en cours, affecter négativement la qualité de vie et prédisposer à l'arthrose. Au cours des dernières décennies, plusieurs techniques chirurgicales ont été développées pour traiter ces lésions. Toutefois, jusqu'à présent, il n'était pas possible d'obtenir une réparation complète en termes de couverture du défaut de cartilage articulaire hyalin ou de fournir récupération satisfaisante à long terme ^2-4. Par conséquent, les blessures du cartilage articulaire restent une cible privilégiée pour les techniques régénératrices telles que l'ingénierie tissulaire. Contrairement à d'autres techniques chirurgicales, qui conduisent souvent à la formation de tissu fibreux ou fibrocartilaginous, génie tissulaire vise à rétablir pleinement la structure complexe et les propriétés du cartilage articulaire d'origine en utilisant le potentiel chondrogénique des cellules transplantées. Res dernières évolutions ont ouvert des perspectives prometteuses pour les thérapies régénératrices du cartilage.

La première approche à base de cellules pour le traitement de cartilage de pleine épaisseur ou de lésions ostéochondrales a été réalisée en 1994 par Lars Peterson et Mats Brittberg pionnier de l'implantation de chondrocytes autologues clinique (ACI) ^5. Aujourd'hui, la technique est cliniquement bien établie pour le traitement des grands défauts du cartilage hyalin du genou, le maintien de bons résultats cliniques même de 10 à 20 ans après l'implantation ^6. Au cours des dernières années, l'implantation de chondrocytes autologues a subi une progression rapide. L'utilisation d'une tridimensionnel de collagène matrice artificielle sur laquelle les cellules sont ensuite replantés est devenu de plus en plus populaire ^9.7.

MACT comporte de deux interventions chirurgicales: d'abord, afin de recueillir des chondrocytes, une biopsie de cartilage doit être effectuée à partir d'une zone de cartilage non mise en charge de til articulation du genou. Ensuite, les chondrocytes sont extraits, purifiés et étendues à un nombre de cellules suffisant in vitro. Les chondrocytes sont ensuite ensemencées sur une matrice en trois dimensions et peuvent être ensuite réimplantées. Lors de la préparation d'un implant par génie tissulaire, le taux de prolifération et la différentiation sont cruciales pour une régénération des tissus réussi ^10. L'utilisation d'une matrice tridimensionnelle comme un support de cellules est pensé pour soutenir ces caractéristiques cellulaires ^11.

Le protocole suivant résumera et démontrer une technique pour isoler les chondrocytes à partir de biopsies de cartilage, leur prolifération in vitro et leur ensemencement sur une matrice 3D (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Suisse). Enfin, l'implantation des cellules-matrice-constructions en défauts chondrales créés artificiellement de l'articulation du genou d'un lapin sera décrite. Cette technique peut être utilisée comme un cadre expérimentalpour d'autres expériences de la réparation du cartilage.

Protocole

A. biopsie de cartilage (Salle de chirurgie; étapes 1-5 dans la salle de préparation non stérile)

Effectuer un contrôle du poids final du lapin (Nouvelle-Zélande lapin blanc, femelle, 3,5-4,0 kg de poids corporel, âgé de 6 mois) afin de pouvoir doser médicaments correctement et de surveiller le poids après la chirurgie.
Induire une anesthésie au lapin par une injection intraveineuse de 10 mg / kg de propofol.
Après l'intubation, maintenir l'anesthésie avec 1,5 mg / kg / min propofol et 0,05 mg / kg de fentanyl par voie intraveineuse. Surveiller anesthésie en utilisant la capnographie, l'oxymétrie de pouls et de la fréquence du pouls.
Raser le genou à opérer avec une tondeuse électrique et vide la fourrure.
Désinfecter le genou rasée à fond et couvrir le reste du lapin avec un pansement stérile.
Palper la rotule et d'effectuer une incision de la peau médiane de la rotule.
Ouvrez l'articulation du genou par une arthrotomie parapatellaire interne dans des conditions stériles. Essayez d'éviter de couper une petite suvaisseaux sanguins perficial.
Déplacer la rotule latéralement.
Inspectez l'articulation du genou pour toutes les anomalies et les lésions cartilagineuses macroscopiques.
Retirer délicatement les petits morceaux de cartilage (2-3 mm) de la trochlée ossis fémoral avec un scalpel stérile (Figure 1).
Immédiatement placer ces biopsies de cartilage dans un tube de 50 ml avec du milieu complet (DMEM + 10% sérum de veau foetal (FCS) + 1% de pénicilline / streptomycine (Pen / Strep)) à poursuivre le du chef de culture in vitro après l'opération.
Nettoyez les défauts et les rincer avec une solution saline stérile.
Repositionner la rotule dans la gorge trochlée.
Fermeture de la plaie en couches avec bouton sutures simples (4-0 Vicryl) et une suture cutanée continue (4-0 Monocryl). Utilisez du matériel de suture absorbable.
Enfin, sceller la plaie avec un spray pansement perméable à la vapeur d'eau.

B. culture in vitro

Traiter la biopsie cmorceaux de artilage dès que possible après l'opération dans une hotte de culture tissulaire à flux laminaire stérile.
Laver le stérile récolté cartilage 2x dans PBS avec centrifugation subséquente à 500 g pendant 3 min à température ambiante.
Couper en morceaux de cartilage 1 mm ^3, transfert vers un Falcon 50 ml et digérer sur un agitateur pendant 30 min avec 10 ml de trypsine-EDTA (0,25%) et 10 ml de PBS pendant 30 min
Après 30 minutes, arrêtez la trypsine en ajoutant un milieu complet. Ensuite, serrer les morceaux de cartilage pour un autre pendant 12 heures avec de la collagénase A (0,21 U / mg) dans un milieu sans sérum (DMEM + 1% Pen / Strep).
Centrifuger la solution résultante à 170 g pendant 3 min à température ambiante.
Remettre en suspension les culots de cellules dans 5 ml de milieu complet.
Ensemencer les chondrocytes isolés sur 25 cm ² flacons de culture de tissus dans 5 ml de milieu complet et garder dans une culture tissulaire incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO _2.
Cultiver des chondrocytes à une densité de 80%.
Libérer les cellules fflacons de ROM en lavage en PBS 2x avant de l'exposer à 0,05% de trypsine-EDTA pendant 3 min. Une fois chondrocytes se détachent, arrêter la trypsine par addition de 10 pi de milieu complet.
Centrifuger la suspension à 300 g (3 min) et remettre le culot dans un milieu complet.
cellules de semences dans des flacons de culture de tissus (75 cm ²⁾ et le partage dans un rapport de 1:3 (~ 5000 cellules / cm ²⁾ toutes les 5 ^e jour ou à 80% de confluence.
Déterminer le nombre de cellules et la viabilité par coloration au bleu trypan.

C. culture des cellules de la matrice

Avant de lavage d'implantation et les cellules de libération tel que décrit ci-dessus. Effectuer le nombre de cellules et de transférer 5 x 10 ⁴ cellules dans un tube de 1,5 ml. Puis centrifuger à 500 g pendant 5 min à température ambiante.
Resuspendre le culot dans 15 ul de milieu complet pour une saturation complète de la matrice.
Couper la bicouche échafaudage de collagène aux dimensions exactes du défaut trochlear par une biopsie stérilepunch.
Lieu matrice dans un plat de culture de tissus de taille appropriée (par exemple des plaques à 24 puits).
des cellules de semence sur la face poreuse, adhésif de cellule de la matrice. Cela décourage la migration cellulaire loin de la matrice.
Laisser matrices de cellules ensemencées sans autre milieu de culture des cellules dans un incubateur pendant 1 heure pour permettre le plein respect des chondrocytes.
Ensuite, placez cellule-matrice-constructions dans des récipients de culture (par exemple des plaques à 24 puits) avec un milieu complet frais. Prenez soin de ne pas laver les cellules au large de la matrice même si une forte adhésion est attendue.
Maintenant, cell-matrix-constructions peuvent être prises pour la salle de chirurgie pour une nouvelle implantation.

D. assistée par matrice transplantation de chondrocytes autologues

Effectuer arthrotomie parapatellaire au genou controlatéral comme décrit ci-dessus (A. 1-8).
Créer deux défauts cartilagineuses isolées dans la gorge de la trochlée avec un operatin d'air stérileg perceuse électrique (3,6 mm de diamètre).
Nettoyez le défaut et rincer avec une solution saline stérile.
Il faut faire attention de ne pas ouvrir la cavité de la moelle à tout moment. Si nécessaire, sceller le fond des défauts avec cautérisation électrique contre les saignements.
Implant les matrices ensemencées avec les chondrocytes en culture avec la face vers le bas de la face poreuse (figure 2). Puis press-fit dans les trous de forage et rincer la surface environnante.
Sceller les matrices implantés avec un peu de colle de fibrine (Tissucol Duo S) afin d'assurer une fixation sûre.
Après coagulation, déplacer la rotule à l'intérieur de la gorge de la trochlée et appliquer gamme complète de mouvement de l'articulation du genou à quelques reprises.
Déplacer la rotule latéralement une fois de plus et vérifier pour tout événement ou signe de fixation instable. Les matrices doivent être tenus toujours en place.
Remplacez à nouveau la rotule et terminer l'opération avec la fermeture des plaies dans les couches et les embruns s'habiller comme décrit ci-dessus.