Traitement des défauts ostéochondraux à genou la commune du lapin par implantation de cellules allogéniques souches mésenchymateuses dans caillots de fibrine

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4423

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Article de méthode

Traitement des défauts ostéochondraux à genou la commune du lapin par implantation de cellules allogéniques souches mésenchymateuses dans caillots de fibrine

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DOI :

10.3791/4423

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21 mai 2013

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Une technique expérimentale pour le traitement de défauts ostéochondraux dans l'articulation du genou du lapin est décrite. L'implantation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques dans des défauts ostéochondraux offre un développement prometteur dans le domaine de l'ingénierie tissulaire. La préparation de la fibrine cellule caillots In vitro Offre une méthode normalisée pour l'implantation.

Résumé

Le traitement des lésions ostéochondrales articulaires a longtemps posé problème aux médecins. Une meilleure compréhension des interactions entre le cartilage articulaire et l'os sous-chondral ces dernières années a conduit à un intérêt accru pour la restauration de l'ensemble du compartiment ostéochondral. Par rapport aux lésions chondrales, la régénération des défauts ostéochondraux est beaucoup plus complexe et constitue un défi chirurgical et thérapeutique bien plus important. Le tissu lésé ne comprend pas seulement la couche superficielle du cartilage, mais aussi l'os sous-chondral. Dans les lésions profondes, telles qu'elles se produisent par exemple dans l'ostéochondrite disséquante, il est nécessaire de remplacer toute l'épaisseur du défaut afin de restaurer la surface articulaire ¹. Les procédures thérapeutiques adéquates doivent tenir compte de ces deux tissus différents et de leur potentiel de cicatrisation intrinsèque distinct ². Ces dernières décennies, plusieurs options de traitement chirurgical ont émergé et sont déjà établies cliniquement ^3-6.

Les greffes ostéochondrales autologues ou allogéniques comprennent du cartilage articulaire et de l'os sous-chondral et permettent le remplacement complet de l'unité ostéochondrale. Les défauts sont comblés par des greffons ostéochondraux cylindriques destinés à fournir une surface recouverte de cartilage hyalin congruent ^3,7,8. Les inconvénients sont le nombre limité de greffons disponibles, la morbidité du site donneur (pour les greffes autologues) et l'incongruence de la surface ; par conséquent, l'application de cette méthode est particulièrement limitée aux défauts étendus.

De nouvelles approches dans le domaine du génie tissulaire ont ouvert des perspectives prometteuses pour la thérapie régénérative ostéochondrale. L'implantation de chondrocytes autologues a marqué la première approche biologique basée sur les cellules pour le traitement des lésions cartilagineuses en plein épaisseur et est désormais établie dans le monde entier, avec de bons résultats cliniques même 10 à 20 ans après l'implantation ^9,10. Toutefois, à ce jour, cette technique n'est pas adaptée au traitement de tous les types de lésions, comme les défauts profonds impliquant l'os sous-chondral ¹¹.

La technique sandwich associe la greffe osseuse aux approches actuelles de l'ingénierie tissulaire ^5,6. Cette combinaison semble capable de surmonter les limites observées avec les greffes ostéochondrales seules. Après la greffe osseuse autologue dans la zone lésée du cartilage sous-chondral, une membrane ensemencée avec des chondrocytes autologues est suturée par-dessus et facilite l'adaptation de la topologie de la greffe à celle du site lésé. Bien entendu, la reconstruction osseuse préalable nécessite un temps chirurgical supplémentaire et parfois même une intervention chirurgicale additionnelle. De plus, à ce jour, des données à long terme font défaut ¹².

L'ingénierie tissulaire sans greffe osseuse supplémentaire vise à restaurer la structure complexe et les propriétés du cartilage articulaire natif grâce au potentiel chondrogénique et ostéogénique des cellules transplantées. Toutefois, là encore, c'est généralement seulement le tissu cartilagineux qui est plus ou moins régénéré. Une lésion ostéochondrale supplémentaire nécessite un traitement spécifique complémentaire. Afin d'obtenir une régénération de la structure multicouche des défauts ostéochondraux, des produits tridimensionnels conçus par ingénierie tissulaire, ensemencés avec des cellules autologues ou allogéniques, pourraient offrir une bonne capacité de régénération ¹¹.

Outre les chondrocytes autologues, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) semblent constituer une alternative intéressante pour le développement d'un tissu cartilagineux en épaisseur totale. Dans de nombreuses études précliniques in vitro et in vivo, les cellules souches mésenchymateuses ont montré un excellent potentiel de régénération tissulaire ^13,14. Leur avantage majeur, notamment pour le traitement des défauts ostéochondraux, réside dans leur capacité à se différencier à la fois en ostéocytes et en chondrocytes. Elles permettent ainsi potentiellement une régénération multicouche du défaut.

Ces dernières années, plusieurs échafaudages présentant un potentiel régénératif ostéochondral ont donc été mis au point et évalués, avec des résultats préliminaires prometteurs ^1,15-18. Par ailleurs, la colle de fibrine utilisée comme vecteur cellulaire est devenue l'une des techniques privilégiées dans la réparation expérimentale du cartilage et a déjà été utilisée avec succès dans plusieurs études animales ^19-21 et même dans des premiers essais chez l'homme ²².

Le protocole suivant démontrera une technique expérimentale permettant d'isoler des cellules souches mésenchymateuses à partir de la moelle osseuse d'un lapin, puis de les faire proliférer en culture cellulaire et de préparer un modèle standardisé in vitro de caillots fibrine-cellules. Enfin, une technique d'implantation de caillots fibrine-cellules préformés dans des défauts ostéochondraux artificiels de l'articulation du genou du lapin sera décrite.

Protocole

A. Préparation d'un lapin de donateurs pour l'isolement des cellules souches mésenchymateuses (salle d'opération)

Les cellules sont isolées à partir de New blancs (NZB) lapins mâles Zélande à l'âge de 4 mois et environ 3 kg de poids corporel.
Induire une anesthésie par propofol (10 mg / kg de poids corporel iv) et le sacrifice avec du pentobarbital sodique (100 mg / kg de poids corporel iv).
Rasage fourrure de membres postérieurs, le dos et le ventre avec une tondeuse électrique et l'aspirateur sur la fourrure.
Désinfectez la zone rasée soigneusement avec de l'éthanol à 70%.
Utilisez une pince émoussée, ciseaux pointus (ou scalpel) et les couteaux en os pour les tissus et les ligaments.
Faire une incision le long de la surface crânienne de la jambe et du mollet.
Refléter la peau et du tissu sous-cutané soit par dissection tranchants ou contondants.
Séparez les muscles et les ligaments du tibia et du fémur. Gardez coupes aussi près de l'os que possible de faire une dissection propre. Ne pas séparer fémur tibia en ce moment.
Couper THRough l'articulation de la hanche pour séparer la tête du fémur dans le cotyle.
Élever le complexe tibio-fémorale.
Utilisez le scalpel pour gratter les tissus mous reste de l'os ou les os frotter avec des tissus de tissu stérile. À ce stade, le fémur et le tibia sont toujours connectés.
Retirer la rotule en coupant, puis couper les ligaments du genou aux os séparés enfin.
Pulvérisation os séparé avec 70% d'éthanol, laissez sécher à l'air et placez chaque os dans un tube à centrifuger de 50 ml avec un milieu de culture cellulaire (DMEM + 1% de pénicilline / streptomycine (Pen / Strep)) pour les garder humides.
Maintenant basculer sous une culture hotte à flux laminaire stérile cellulaire.

B. Rinçage des MSC de lapin de Bones et extension (Culture Cellulaire Hood)

Collectez les os de tubes et de les placer dans des boîtes de 150 mm à l'aide de pinces stériles.
Retirez les deux extrémités des os avec une scie stérile et déplacer les pièces de nouveaux plats de 150 mm.
Remplir une seringue de 10 ml avec medium (DMEM), attacher une aiguille de calibre 18 et de l'insérer dans l'ouverture de la moelle osseuse.
Ensuite, rincez cavité de la moelle avec le milieu pour vider la moelle osseuse dans le plat. Ensuite, rincez à l'autre bout, si possible. Si nécessaire, sciez plus à partir des extrémités. Si l'os se casse, il suffit de rincer l'intérieur de l'os.
Aspirer la suspension d'un milieu de cellules dans la seringue et rincer la moelle osseuse jusqu'à ce que la suspension demeure mobile à travers la cavité de la moelle osseuse et pas plus loin de la moelle osseuse des caillots apparaissent.
Une fois la moelle osseuse ont été recueillies à partir de tous les os, perturber les touffes de moelle en passant par une aiguille de calibre 18: remplir une seringue avec une aiguille attachée et le forcer à en moyenne.
Ensuite, on filtre la suspension à travers un filtre de cellules dans un tube de 50 ml. Afin d'éviter la perte de cellules, lavez culture plat 2x avec 10 ml de milieu et de filtrer ainsi.
Centrifuger la suspension à 500 g pendant 5 min à température ambiante.
Retirer le surnageant et remettre en suspension cellulaire pêleet dans 10 ml de milieu (DMEM + 1% Pen / Strep).
Globules Séparez les périphériques cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et les cellules souches mésenchymateuses (CSM) en utilisant une solution de séparation Biocoll.
Remplissez 5 ml de Biocoll Séparation solution dans un tube de 15 ml et ajouter avec précaution 5 ml de suspension cellulaire sur le dessus et centrifuger à 800 g pendant 20 min à température ambiante (sans frein).
Résultats possibles, voir Figure 1: Etre plus dense que Biocoll, globules rouges sédiments au fond tandis que les cellules souches mésenchymateuses CMSP et restent à l'interface.
Retirez délicatement interface dans un tube de 15 ml et laver avec 5 ml de PBS.
Centrifuger comme décrit dans l'étape 22, remettre en suspension dans 5 ml de PBS et répéter 2 à 3 fois.
Ensuite, centrifuger à 350 g pendant 10 min à température ambiante (avec frein).
Remettre en suspension dans 10 ml de milieu et de compter les cellules dans un hémocytomètre.
Cellules de la plaque à une densité d'ensemencement initial de l'ordre de 5 x 10 ⁶ à 150 plats mm.
Après 2-3 jours, redéplacer les cellules non adhérentes. Vous pourriez avoir à rincer avec PBS premier pour éliminer les débris cellulaires. Ajoutez milieu complet frais (DMEM + 10% sérum de veau foetal (FCS) + 1% Pen / Strep) par la suite.
Nourrir les cellules tous les 3-4 jours (Figure 2).
Après 5-10 jours, le passage des cellules pour la première fois.

C. Préparation des caillots de fibrine in vitro

Au jour de l'implantation, libérer les cellules adhérentes de flacons / plats par un min-exposition de 3 à 0,25% de trypsine-EDTA. Arrêter la trypsine en ajoutant un milieu complet.
Distribuer des cellules dans un tube Falcon de 50 ml et les laver deux fois avec PBS.
Déterminer la viabilité cellulaire et numéros par coloration au bleu trypan.
Ajouter 50.000 cellules / tube de centrifugation et recueillir pellets par centrifugation à 500 g pendant 5 min à température ambiante. Préparation d'un mélange maître pour au moins un caillot plus que nécessaire.
Reprendre le culot cellulaire dans 17 pi de PBS et mélanger 25 ul de la composante de fibrinogène TISSUCOL-Kit avec cette 17 ul suspension de MSC.
Prenez une plaque stérile avec des trous pré-percés (3x3.6 mm), conformément à des trous de forage in vivo (figure 3).
Tout d'abord, ensemencer une solution de thrombine 4 pi (500 UI / ml) dans un trou, suivie de l'addition immédiate de 42 ul de fibrinogène suspension cellulaire et de nouveau quatre solution de thrombine pi sur le dessus. Ne pas mélanger la suspension pour éviter la coagulation dans la pointe de la pipette. Tout d'abord, le volume de 50 ul du fibrinogène suspension cellulaire pipetté doit dépasser le bord des trous pré-percés sans fondre en raison de la tension de surface. Cependant, après coagulation complète (après 60 min) le caillot se contracte et se glisse dans le trou pré-percé.
Retirez le caillot soigneusement à l'aide d'une pince émoussée et le placer dans un tube à centrifuger avec PBS. Préparer 2 caillots / animal.
Prenez les caillots à la salle de chirurgie.

D. Implantation des allogéniques de cellules souches mésenchymateuses dans caillots de fibrine

Induire une anesthésie de lapin (NZB, mâle, 3,5-4,0 kg de poids corporel, vieux 5-6 mois) par injection intraveineuse de propofol (10 mg / kg de poids corporel).
Raser le genou à opérer avec une tondeuse électrique et vide la fourrure. Toutes les procédures nommés avant sont effectuées dans une salle de préparation de la chirurgie pour éviter la contamination de l'environnement stérile de la salle d'opération.
Après l'intubation, maintenir l'anesthésie avec 1,5 mg / kg / min propofol et 0,05 mg / kg / min fentanyl par voie intraveineuse. Surveiller anesthésie en utilisant la capnographie, l'oxymétrie de pouls et de la fréquence du pouls.
Désinfecter le genou rasée à fond et couvrir le reste de lapin avec un pansement stérile.
Palper la rotule et d'effectuer une incision de la peau interne de la rotule.
Ouvrez l'articulation du genou par une arthrotomie parapatellaire interne dans des conditions stériles. Essayez d'éviter de couper des petits vaisseaux sanguins superficiels.
Déplacer la rotule latéralement (Figure 4).
Après Inspection de l'articulation de genou pour les lésions du cartilage concomitantes ou anomalies communes, créer deux défauts ostéochondraux (3 mm de profondeur, la figure en forme de huit) dans la gorge de la trochlée avec une perceuse électrique de commande de l'air stérile (3,6 mm de diamètre) avec un dispositif d'arrêt (Figure 5).
Nettoyez les défauts et les rincer avec une solution saline stérile.
Avant l'implantation, remplir 20 pi de colle de fibrine dans les défauts et les distribuer uniformément sur le fond du défaut.
Puis implanter les caillots emmanché dans la figure défaut en forme de huit.
Après coagulation, déplacer la rotule à l'intérieur de la gorge de la trochlée et plier et étirer le genou à quelques reprises.
Déplacer la rotule latéralement une fois de plus et vérifier si fibrinogène cellulaires caillots sont toujours en place.
Remplacez à nouveau la rotule et terminer l'opération de fermeture de la plaie en couches avec bouton sutures simples (4-0 Vicryl) et une suture cutanée continue (4-0 Monocryl) (tous deux avec suture absorbablematériel).
Enfin, sceller la plaie avec un spray pansement perméable à la vapeur d'eau.
Pour les soins post-opératoires, la blessure est vérifiée par jour pendant 7 jours. Les lapins reçoivent pour l'analgésie post-opératoire Carprofen 4 mg / kg sc toutes les 24 heures (4 jours) et Buprénorphine 0,03 mg / kg sc toutes les 12 heures (pendant 2,5 jours). Une stabilisation du genou (par exemple pansement) n'est pas nécessaire.