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Article de méthode

Imagerie pHluorin-étiqueté insertion du récepteur de la membrane plasmique dans les neurones primaires de souris en culture

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DOI :

10.3791/4450

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20 novembre 2012

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1The Jackson Laboratory

Dans cet article

Résumé

En marquant les domaines extracellulaires des récepteurs membranaires avec pHluorin superecliptic, et par imagerie par ces récepteurs de fusion dans les neurones de souris en culture, on peut directement visualiser les différents événements d'insertion vésiculaires des récepteurs à la membrane plasmique. Cette technique permet de contribuer à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent l'insertion du récepteur à la membrane plasmique.

Résumé

Une meilleure compréhension des mécanismes qui régissent le trafic des récepteurs entre la membrane plasmique (PM) et les compartiments intracellulaires nécessite une approche expérimentale avec une excellente résolution spatiale et temporelle. En outre, une telle approche doit également avoir la capacité de distinguer les récepteurs localisés sur la PM de ceux dans les compartiments intracellulaires. Plus important encore, la détection de récepteurs dans une seule vésicule nécessite une sensibilité de détection remarquable, puisque chaque vésicule porte seulement un petit nombre de récepteurs. Les méthodes habituelles pour l'examen trafic des récepteurs comprennent la biotinylation de surface suivie d'une détection biochimique, qui manque à la fois les résolutions nécessaires spatiales et temporelles, et l'examen microscopie à fluorescence de récepteurs de surface immunomarquées, ce qui nécessite la fixation chimique des cellules et manque par conséquent une résolution temporelle suffisante 1-6. Pour surmonter ces limitations, nous et d'autres avons développé et utilisé une nouvelle stragie qui permet la visualisation de l'insertion dynamique des récepteurs dans le PM avec d'excellentes résolutions spatiales et temporelles 7-17. L'approche de marquage comprend de la GFP sensible au pH, l'superecliptic pHluorin 18, pour le domaine extracellulaire N-terminal des récepteurs. Superecliptic pHluorin a la propriété unique d'être fluorescente à pH neutre et non fluorescent à pH acide (pH <6,0). Par conséquent, les récepteurs sont marqués non fluorescente lorsque la lumière à l'intérieur de vésicules acide trafic intracellulaire ou endosomes, et ils deviennent facilement visualiser uniquement lorsqu'il est exposé à l'environnement pH neutre extracellulaire, sur la surface extérieure de l'heure. Notre stratégie permet donc de distinguer les récepteurs de surface de particules provenant ceux dans les vésicules de trafic intracellulaire. Pour atteindre suffisamment de résolutions spatiale et temporelle, ainsi que la sensibilité nécessaire pour étudier le trafic dynamique des récepteurs, nous avons employé interne totale reflètention microscopie à fluorescence (TIRFM), ce qui nous a permis d'atteindre la résolution spatiale optimale de l'imagerie optique (~ 170 nm), la résolution temporelle de la vidéo-microscopie taux (30 images / sec), et la sensibilité à détecter la fluorescence GFP d'un seul molécule. En imagerie pHluorin-récepteurs marqués sous TIRFM, nous avons pu visualiser directement individuelles événements d'insertion du récepteur dans le PM dans les neurones en culture. Cette approche d'imagerie peut potentiellement être appliquée à n'importe quelle protéine membranaire avec un domaine extracellulaire qui pourrait être étiquetés avec pHluorin superecliptic, et permettra à la dissection des mécanismes clés détaillées régissant l'insertion des protéines membranaires (récepteurs différents, les canaux ioniques, transporteurs, etc) à le Premier ministre.

Protocole

1. Préparation de la Culture Glia souris pour le conditionnement de la culture neuronale

  1. Flacons T75 sont revêtues d'une solution de collagène (1:3 de dilution de Purecol en ddH 2 O). Les flacons sont mis debout et a laissé sécher toute la nuit dans une hotte de culture de tissus.
  2. Tampon de dissection (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 30 mM de glucose, 25 mM d'HEPES, pH 7,4, sans calcium) et des médias gliales (DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 10 unités / ml de pénicilline, 10 ug / ml de streptomycine et Glutamax) sont préparés et conservés à 4 ° C jusqu'à utilisation.
  3. Le jour de la culture les cellules gliales, les médias glie est chauffé pendant au moins 30 min dans un bain à 37 ° C de l'eau avant la dissection des cerveaux de souris. Souris embryonnaires ou néonatale sont euthanasiés par décapitation rapide. Cortex cérébral sont disséqués sous un microscope à dissection.
  4. Tissus cérébraux disséqués sont digérés dans une solution de papaïne (100 ml papaïne et 20 ul DNase I 1% dans 2 ml de tampon de dissection) à 37 ° C for 20 min.
  5. Après digestion par la papaïne, les tissus du cerveau sont rincés avec 10 ml de milieu gliales préchauffées. Médias gliales fraîches (2 ml) est ensuite ajouté à digérer les tissus du cerveau et les tissus sont triturés avec une pipette en verre polies au feu Pasteur.
  6. Médias gliales frais (8 ml) est ajouté aux tissus dissociés. Un um 70 cellule-filtre est utilisé pour filtrer la suspension de tissu dissocié. Les cellules sont ensuite ensemencées dans des flacons T75 (habituellement 2-3 embryons de pouvoir ensemencer une fiole T75) et placé dans une cellule de 37 ° C incubateur de culture.
  7. Le lendemain, les médias des flacons T75 est aspiré. Les flacons sont rincés avec 10 ml de PBS. Médias gliales fraîches (10-15 ml) est ensuite ajouté à chaque flacon.
  8. Dans les 10-12 jours, gliale dans les flacons T75 devrait être confluentes. Les cellules gliales sont rincées avec du PBS, et 5 ml de trypsine à 0,05% est ajouté à chaque flacon T75.
  9. Après une incubation de trypsine à 37 ° C pendant 5 min, les cellules gliales sont des cellules dissociées et gliales de chaque flacon T75 sont divisés en deuxrevêtus de collagène différents flacons T75.
  10. Inserts de culture (Millipore PICM03050) sont préparés en les plaçant dans des plaques de 6 puits, les revêtements de collagène et de l'air de séchage du jour au lendemain. Médias gliales (2 ml) est placée en dessous de chaque insert de culture.
  11. Les cellules gliales confluentes de flacons T75 sont trypsinisées et ensemencées sur les inserts de culture (un flacon T75 par plaque de 6 puits, 2 ml chaque insert). Ces inserts de culture des cellules gliales seront utilisés pour conditionner les cultures neuronales.

2. Culture neuronale

  1. Les lamelles de verre pour la culture neuronale sont nettoyés en les trempant dans 70% HNO 3 au moins une nuit. Lamelles sont ensuite lavées avec DDH 2 O au moins 3 fois, et séché dans un four Isotemp (> 200 ° C) pendant une nuit.
  2. Lamelles nettoyés sont placés dans une plaque à 6 puits, une lamelle par puits. Lamelles sont recouvertes de poly-L-Lysine solution (2 ml, 0,1% dans 100 mM d'acide borique, pH = 8,5) pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° C.
  3. Lapoly-L-Lysine solution est retiré des lamelles et des lamelles sont lavées 3 fois avec autoclave ddH O. 2 Lamelles sont ensuite incubée à 37 ° C pendant la nuit dans des milieux d'étalement (Neurobasal supplémenté avec du sérum de cheval à 5% inactivé par la chaleur, 10 unités / ml de pénicilline, 10 pg / ml de streptomycine, Glutamax incubateur; 2% B27 supplément est ajouté au milieu d'étalement le jour où il est utilisé).
  4. Le lendemain, les milieux d'étalement est supprimé et 2 ml de milieu frais avec placage B-27 est ajouté à chaque puits qui a une lamelle de verre.
  5. Des souris gravides (E15-18) sont euthanasiés au CO 2 et souris embryonnaires sont euthanasiés par décapitation. L'hippocampe ou striatum est disséqué du tissu cérébral et placé dans un tube conique de 15 ml avec du tampon glacé dissection, pour la culture de neurones de l'hippocampe ou du striatum neurones épineux de taille moyenne, respectivement.
  6. Les tissus du cerveau disséqué sont dissociées avec de la papaïne, comme décrit dans les étapes 1.4) et 1.5).
  7. FaA près de dissociation, le nombre de cellules dans chaque suspension neuronale est compté avec un hémocytomètre. Les neurones sont ensuite ensemencées sur chaque lamelle à une densité de 0,4 x 10 6 cellules par puits d'une plaque à 6 puits et cultivées dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit (les neurones sont DIV 0).
  8. Pour préparer des inserts de culture des cellules gliales pour le conditionnement des cultures de neurones, les cellules gliales support est retiré des inserts de culture des cellules gliales et milieu frais est ajouté de placage (2 ml dans l'insert et 2 ml en dessous de l'insert).
  9. Le lendemain (DIV 1), des lamelles avec les neurones sont placés sous les inserts de culture des cellules gliales, une lamelle dans chaque puits.
  10. Les neurones sont nourris avec la moitié du volume des nouvelles des médias d'alimentation préchauffées (avec B-27) tous les 3-4 jours jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour des expériences de transfection et d'imagerie.

3. Transfection

  1. Transfection neuronale est réalisée en utilisant Lipofectamine 2000. Pour chaque culture neuronale (une culture par lamelle), 2 plLipofectamine 2000 et 1 pg d'ADN sont utilisés. Frais milieu Neurobasal sans supplément sert à diluer la Lipofectamine et de l'ADN.
  2. ADN et Lipofectamine sont incubées pendant 20 min à température ambiante après mélange.
  3. Économisez 1 ml du milieu du dessous de chaque insert de culture les cellules gliales, et 1 ml de l'intérieur de chaque pièce, et de transférer les données sur un tube conique. Ajouter le même volume de médias d'alimentation + B27 au milieu sauvé et incuber à 37 ° C. Ce milieu est utilisé pour la culture neuronale suite à la transfection.
  4. Après le 20-min Lipofectamine / ADN incubation, les inserts de culture des cellules gliales sont retirés momentanément des plaques de 6 puits. 200 ul de la Lipofectamine / ADN mélange est ajouté à chaque lamelle avec des neurones. Les inserts de culture des cellules gliales sont ensuite retournés à chaque puits, au-dessus des neurones. Génération de bulles sous la membrane des inserts de culture doit être évitée. Neurones sont incubés avec le mélange Lipofectamine / ADN à 37 ° C pendant 2-4 h.
  5. Après èmee période d'incubation 2-4 h, inserts gliales sont retirés à nouveau. Les milieux de culture avec le mélange Lipofectamine / ADN est éliminé de chaque puits. Les supports enregistrés à l'étape 3,3) est ajouté à neurones (2 ml par puits). Inserts de culture des cellules gliales sont retournés à chaque puits, et les médias gliales de chaque insert est enlevé, et 2 ml du milieu de l'étape 3.3) est ajouté dans chaque pièce.
  6. Les neurones sont cultivées pendant une heure supplémentaire 24-72 pour permettre l'expression de l'ADNc transfecté avant la FRBR imagerie est réalisée sur ces neurones.

4. FRBR imagerie

  1. Liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF: 119 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 30 mM de glucose, 2 mM de CaCl2, MgCl2 1 mM, HEPES 25 mM, pH = 7,4) sera utilisé pour le live expériences d'imagerie. Notre système d'imagerie TIRF est spécialement mis en place avec un laser de 100 mW-Cyan pour l'excitation, et une charge de multiplication d'électrons Coupled Device (EMCCD) caméra pour un détecteur.
  2. Avant d'expériences d'imagerie, le aCSF est averti dans un 37 & dpar exemple, l'eau de bain C pendant au moins 30 min. L'insert de chauffage pour l'imagerie en temps réel est placé sur la platine du microscope, et l'insert de chauffage, laser et la caméra sont chauffés pendant au moins 30 min avant le début des expériences d'imagerie.
  3. Une lamelle de neurones transfectés est monté dans la chambre de formation d'image en direct. Le aCSF préchauffé est placé dans la chambre après que la chambre est assemblé; cette étape doit être réalisée le plus rapidement possible.
  4. Une fois la chambre est placée sur l'insert de chauffage sur la platine du microscope, les neurones transfectées sont identifiées visuellement en mode d'imagerie épi-fluorescence.
  5. Après sains neurones transfectées sont identifiées (voir les figures 1 et 2), nous effectuent généralement 1 min de photo-blanchiment pour éliminer préexistante fluorescence pHluorin sur la membrane plasmique, comme pHluorin-récepteurs sur la membrane plasmique des niveaux très élevés de fluorescence lorsque FRBR imagerie est commencé, ce qui interfère avec la visualisation des ins individuelsévénements ertion.
  6. Après photoblanchiment, le réglage de gain du multiplicateur d'électrons sur l'appareil photo EMCCD est réglé au maximum, et l'enregistrement est effectué pendant 1 min à 10 Hz.
  7. Chaque enregistrement contiendra 600 images. Événements d'insertion individuels sont identifiés en jouant à l'arrière d'enregistrement en utilisant ImageJ. Événements d'insertion individuels sont analysés manuellement à l'aide ImageJ.

5. Les résultats représentatifs

Conformément culture neuronale est la clé du succès des expériences d'imagerie en direct. Figure 1 montre des neurones de souris hippocampe en culture en utilisant notre protocole de DIV DIV 11 à 18 ans. Il est clair à partir des images que les neurones ont développé des processus vastes et que les processus dendritiques sont couverts denses avec des épines dendritiques, des indications que ces neurones sont en bonne santé dans la culture. Notre protocole de culture peut également être utilisé pour d'autres types de neurones dans le cerveau. Par exemple, nous avons récemment utilisé ce protocole pour la culturestriataux neurones épineux de taille moyenne dans une étude visant à examiner des récepteurs dopaminergiques D2 (DRD2) insertion dans des cultures de neurones du striatum de souris épineux de taille moyenne 9. Figure 2 montre souris striataux neurones épineux moyens cultivées en utilisant notre protocole à DIV 8. Nous avons également réalisé avec succès la FRBR imagerie de superecliptic DRD2s pHluorin-marqués dans ce type de neurone. Figure 3 montre l'expression de pHluorin-étiqueté DRD2 (pH DRD2) dans un neurone épineux moyen et visualisation de pH DRD2 insertion dans ce neurone.

figure-protocol-1
Figure 1. Souris culture hippocampe en utilisant la méthode de culture de l'interface. DIV: jours in vitro, la journée de la culture est considérée comme DIV 0. A partir des images, il est évident que les neurones hippocampiques matures dans ce type de culture entre 11 et DIV DIV 15. A DIV 11 et 13, les dendrites neuronales sont couverts de filipodes et les épines immatures. A DIV 15 et18, dendrites neuronales sont couverts de grandes épines, une indication de plus de neurones matures. Panneaux de gauche: faible grossissement des images de neurones hippocampiques de souris à différents âges. Panneaux de droite: à très fort grossissement des images (zoom sur dendrites neuronales du panneau de gauche) de neuronales des processus dendritiques avec des épines dendritiques à des âges différents.

figure-protocol-2
Figure 2. Souris striatale moyen épineux neurone culture en utilisant la méthode de culture de l'interface. Neurones dans les images sont moins DIV 8.

figure-protocol-3
Figure 3. Une souris moyenne du striatum neurone épineux transfectées avec un super écliptique récepteur pHluorin-étiqueté D2 de la dopamine (pH DRD2). L'image à gauche est la projection d'intensité maximale d'un enregistrement time-lapse (600 images, 100 ms par image). Flèches blanches indiquent individuelle d'insertion vésiculaire de pH-DRD2. Cette image ne conserve les renseignements insertion dans la dimension xy mais perd les informations de temps. L'image de droite montre yt projection d'intensité maximale, dans laquelle la pile est xyt rotation de 90 degrés autour de l'axe y, et le maximum de pixels sur chaque ligne de l'axe des x est projetée sur un seul axe y de pixel. Cette image conserve des informations d'insertion le long de l'axe yt mais perd les informations axe x.

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Discussion

Pour des raisons inconnues, les neurones de souris sont toujours plus difficiles à la culture de neurones de rat. Dans notre expérience, une culture mixte des neurones et des cellules gliales fonctionne bien pour les neurones primaires de souris en culture. Cependant, une telle culture mixte n'est pas adapté pour des expériences d'imagerie TIRF, comme dans ce type de neurones de la culture et de leurs processus ont tendance à croître au-dessus des cellules gliales, situant le corps cellulaires des neurones et le...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Ce travail est soutenu par des fonds de démarrage de The Jackson Laboratory.

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Matériaux

Dulbecco saline tamponnée (DPBS)
Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Société Commentaires
Purifié solution de collagène bovin (Purecol) Avancé Biomatrix 5005-B
Hank Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO 14185-045
Pénicilline-streptomycine (Pen Strep) GIBCO 15140-122
GIBCO 11360-070
DMEM glycémie élevée GIBCO 10313-021
Sérum fœtal bovin (FBS)
Glutamax GIBCO 35050-061
Papaïne Worthington Biochemical Corp LS003126
Deoxyribonuclease I de pancréas bovin (DNase I) SIGMA DN25-10MG
GIBCO 14190-144
Trypsine 0,05% GIBCO 25300-054
Poly-L-lysine bromhydrate SIGMA P2636-1G
Acide borique Fisher Scientific- BP 168-500
Moyen Neurobasal GIBCO 21103-049
B-27 sans sérum Supplément GIBCO 17504-044
Sérum de cheval de chaleur inactive GIBCO 26050-070
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668 019
HEPES Fisher Scientific- BP310-500
Millipore PICM03050

Références

  1. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  2. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
  3. Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
  4. Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
  5. Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
  6. Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
  7. Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
  8. Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
  9. Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
  10. Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
  11. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
  12. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
  13. Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
  14. Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
  15. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
  16. Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
  17. Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
  18. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).

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Réimpressions et autorisations

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Plasma Membrane InsertionTotal Internal Reflection Fluorescence MicroscopyReceptor TraffickingDopamine D2 ReceptorSuperecliptic pHluorinVesicle Fusion DetectionLive Cell ImagingNeuronal Culture
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