Imagerie pHluorin-étiqueté insertion du récepteur de la membrane plasmique dans les neurones primaires de souris en culture

Résumé

En marquant les domaines extracellulaires des récepteurs membranaires avec pHluorin superecliptic, et par imagerie par ces récepteurs de fusion dans les neurones de souris en culture, on peut directement visualiser les différents événements d'insertion vésiculaires des récepteurs à la membrane plasmique. Cette technique permet de contribuer à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent l'insertion du récepteur à la membrane plasmique.

Résumé

Une meilleure compréhension des mécanismes qui régissent le trafic des récepteurs entre la membrane plasmique (PM) et les compartiments intracellulaires nécessite une approche expérimentale avec une excellente résolution spatiale et temporelle. En outre, une telle approche doit également avoir la capacité de distinguer les récepteurs localisés sur la PM de ceux dans les compartiments intracellulaires. Plus important encore, la détection de récepteurs dans une seule vésicule nécessite une sensibilité de détection remarquable, puisque chaque vésicule porte seulement un petit nombre de récepteurs. Les méthodes habituelles pour l'examen trafic des récepteurs comprennent la biotinylation de surface suivie d'une détection biochimique, qui manque à la fois les résolutions nécessaires spatiales et temporelles, et l'examen microscopie à fluorescence de récepteurs de surface immunomarquées, ce qui nécessite la fixation chimique des cellules et manque par conséquent une résolution temporelle suffisante ^1-6. Pour surmonter ces limitations, nous et d'autres avons développé et utilisé une nouvelle stragie qui permet la visualisation de l'insertion dynamique des récepteurs dans le PM avec d'excellentes résolutions spatiales et temporelles ^7-17. L'approche de marquage comprend de la GFP sensible au pH, l'superecliptic pHluorin ^18, pour le domaine extracellulaire N-terminal des récepteurs. Superecliptic pHluorin a la propriété unique d'être fluorescente à pH neutre et non fluorescent à pH acide (pH <6,0). Par conséquent, les récepteurs sont marqués non fluorescente lorsque la lumière à l'intérieur de vésicules acide trafic intracellulaire ou endosomes, et ils deviennent facilement visualiser uniquement lorsqu'il est exposé à l'environnement pH neutre extracellulaire, sur la surface extérieure de l'heure. Notre stratégie permet donc de distinguer les récepteurs de surface de particules provenant ceux dans les vésicules de trafic intracellulaire. Pour atteindre suffisamment de résolutions spatiale et temporelle, ainsi que la sensibilité nécessaire pour étudier le trafic dynamique des récepteurs, nous avons employé interne totale reflètention microscopie à fluorescence (TIRFM), ce qui nous a permis d'atteindre la résolution spatiale optimale de l'imagerie optique (~ 170 nm), la résolution temporelle de la vidéo-microscopie taux (30 images / sec), et la sensibilité à détecter la fluorescence GFP d'un seul molécule. En imagerie pHluorin-récepteurs marqués sous TIRFM, nous avons pu visualiser directement individuelles événements d'insertion du récepteur dans le PM dans les neurones en culture. Cette approche d'imagerie peut potentiellement être appliquée à n'importe quelle protéine membranaire avec un domaine extracellulaire qui pourrait être étiquetés avec pHluorin superecliptic, et permettra à la dissection des mécanismes clés détaillées régissant l'insertion des protéines membranaires (récepteurs différents, les canaux ioniques, transporteurs, etc) à le Premier ministre.

Protocole

1. Préparation de la Culture Glia souris pour le conditionnement de la culture neuronale

1. Flacons T75 sont revêtues d'une solution de collagène (1:3 de dilution de Purecol en ddH ₂ O). Les flacons sont mis debout et a laissé sécher toute la nuit dans une hotte de culture de tissus.
2. Tampon de dissection (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1 _mM de MgCl2, 30 mM de glucose, 25 mM d'HEPES, pH 7,4, sans calcium) et des médias gliales (DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 10 unités / ml de pénicilline, 10 ug / ml de streptomycine et Glutamax) sont préparés et conservés à 4 ° C jusqu'à utilisation.
3. Le jour de la cultu....

Discussion

Pour des raisons inconnues, les neurones de souris sont toujours plus difficiles à la culture de neurones de rat. Dans notre expérience, une culture mixte des neurones et des cellules gliales fonctionne bien pour les neurones primaires de souris en culture. Cependant, une telle culture mixte n'est pas adapté pour des expériences d'imagerie TIRF, comme dans ce type de neurones de la culture et de leurs processus ont tendance à croître au-dessus des cellules gliales, situant le corps cellulaires des neurones et le.......

Matériaux

Dulbecco saline tamponnée (DPBS)

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif Société Commentaires
Purifié solution de collagène bovin (Purecol)	Avancé Biomatrix	5005-B
Hank Balanced Salt Solution (HBSS)	GIBCO	14185-045
Pénicilline-streptomycine (Pen Strep)	GIBCO	15140-122
GIBCO	11360-070
DMEM glycémie élevée	GIBCO	10313-021
Sérum fœtal bovin (FBS)
Glutamax	GIBCO	35050-061
Papaïne	Worthington Biochemical Corp	LS003126
Deoxyribonuclease I de pancréas bovin (DNase I)	SIGMA	DN25-10MG
GIBCO	14190-144
Trypsine 0,05%	GIBCO	25300-054
Poly-L-lysine bromhydrate	SIGMA	P2636-1G
Acide borique	Fisher Scientific-	BP 168-500
Moyen Neurobasal	GIBCO	21103-049
B-27 sans sérum Supplément	GIBCO	17504-044
Sérum de cheval de chaleur inactive	GIBCO	26050-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668 019
HEPES	Fisher Scientific-	BP310-500
Millipore	PICM03050